Prova 02 - Resumo - Terapia Gênica

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PROVA 02 – RESUMO – TERAPIA GÊNICA I
RNAs: Estrutura, Síntese e Degradação
Estrutura e Função dos mRNAs
* Polímero linear; (A,U,C,G);
* Açúcar ribose (1 grupo -OH a mais)
* Molécula intermedária na síntese proteica;
* Além de possuir códons para síntese de peptídeos, há sequências regulatórias para:
- Regular frequência da tradução;
- Tempo de sobrevivência do mRNA;
- Local de tradução do mRNA.
* Sequências regulatórias:
- Dispostas em cis: maioria regiões não-codantes (5’ e 3’-UTR); 
- Apoio de ptns associadas.
Síntese de mRNA
* RNA pol:
- I: rRNA 18S/28S
- II: mRNA e alguns RNAs curtos;
- III: tRNA, Rrna 5S e RNAs curtos.
* Cada RNApol tem seu próprio promotor.
* Mecanismo:
- Poliadenilação em 3’;
	- Estabiliza o mRNA;
	- Maior resistência a RNAses (RNAses preferem C-G);
	- Promove a exportação do mRNA e favorece a tradução.
- CAP de 7-metilguanosina em 5’;
	- Estabiliza o mRNA;
	- Serve de sinal para que o RNA possa ser traduzido em ptn;
	- Na tradução: eIF4E se liga ao CAP e inicia a montagem de complexo com outros fatores de iniciação.
- Splicing.
Degradação do mRNA
* RNAs são menos estáveis que o DNA, por conta da –OH (ligação fosfodiéster mais frágil);
* Enzimas degradam RNA: RNAses;
- Clivam as ligações fosfodiéster que conectam os nucleotídeos;
- Também responsável por replicação e reparo do DNA, além do processamento de novos transcritos.
- Tipos de RNAses: 
	- Endorribonucleases: Clivam RNA em sítio interno;
	- Exorribonucleases: Clivam RNA em sua terminação (senso e antisenso)
* Digestão do RNA: expresso em meias-vidas;
* Decaimento de RNAm pode variar:
	- De acordo com as sequências: estabilidade codificada em sequências cis, logo varia entre diferentes RNAs;
		- LEMBRAR: Qtd de mRNA >> qtd de ptns da cél;
		- Instabilidade do mRNA (degradação rápida) permite ajuste na produção de ptns via mudança na transcrição de genes; 
		- Erros de estabilidade >> doenças.
	- De acordo com as espécies: tempo menor em procariotos; tempo aumenta com a complexidade do indivíduo.
* Controle dos níveis de mRNA (steady state): depende de:
- Taxa de síntese;
- Taxa de decaimento.
* Etapas de degradação: 
- Degradação via deadenilação: quebra da cauda poli(A) (até 10nt) por nucleases ou deadenilases
- mRNA é degrada nos sentidos:
	- 5’ → 3: retirada do CAP pela enzima DCP e digestão pela exonuclease Xrn1;
		- Difícil a retirada do CAP por conta da interação eIF4F-PABP (PABP: ptn que liga poli(A) 3’)
		- Se há deadenilação (liberação de PABP) >> desestabilização da interação eIF4F-PABP, expondo o CAP;
		- complexo de ptns Lsm 1-7 liga-se à cauda poli(A) para auxiliar na retirada do capacete.
Figura 2. Desestabilização da interação PABP-eIF4F. (Krebs et al, 2011. Lewin’s Genes X, 10ª ed.)
	- 3’ → 5’: complexo exossomo
* Outras vias de degradação:
- Retirada do CAP independentemente da deadenilação: Retira-se o capacete na presença de longa cauda poli(A);
- Degradação de mRNA de histona, regulado por ciclo celular: pol adiciona cauda poli(U), que serve como plataforma para Lsm1-7 e exossomo;
- Clivagem endonucleolítica: Endonucleases reconhecem sequências/estruturas e clivam o mRNA, seguida de digestão dos fragmentos e retirada do capacete; 
- Silenciamento via miRNA: miRNA guia o complexo RISC até sequências-alvo no mRNA; há clivam endonucleolítica do mRNA ou repressão da tradução.
* Interferência na quantidade de mRNA: Terapia gênica
- mRNA pode interferir nos circuitos de:
	- Mobilidade;
	- Diferenciação e homeostase;
	- Proliferação celular;
	- Viabilidade e sobrevivência celular.
Interferência de RNAs
Biologia molecular do RNA: novas descobertas
* Pequenos RNAs não-codantes regulam genes e genomas, dentre outras funções: 
- Estrutura da cromatina e segregação dos cromossomos;
- Transcrição e tradução;
- Processamento e estabilidade do RNA.
Interferência de RNA: 
* Processo bem conservado evolutivamente, que regula expressão gênica pós-transcricional, principalmente pela interação com mRNAs. (ex. alteração nas cores de uma folha ou dos olhos de uma Drosophila)
- Age como resposta imune inata contra efeitos deletérios de ác. nucleicos invasivos de elementos transpostos, vírus e outros patógenos;
- Também possuem importância no desenvolvimento dos sistemas orgânicos;
- Efeito final mais comum de RNAi: queda da expressão gênica;
- Apresenta potencial terapêutico.
RNAi e tipos de vias:
- Endógena: “desejo” da célula de expressar;
	- miRNAs (microRNAs): regulação da expressão gênica;
	- piRNAs (piwi-interacting RNAs): interferência em céls reprodutivas.
- Exógena: cél naturalmente não possui, e RNAi são inoculados nela.
	- siRNAs (short interfering RNAs): defesa contra vírus e microrganismos invasores; podem ser naturais (ex. vírus) ou sintéticos (ex. vetores de expressão).
miRNAs
Aspectos gerais de miRNAs:
* dsRNAs curtos (~22nt); sequências não-codantes;
* Funções: regulação gênica pós-transcricional (desenvolvimento, diferenciação celular, proliferação e apoptose);
* Patogênese e terapêutica de doenças: câncer e doenças neurológicas.
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Síntese de miRNAs
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1) Transcrição e Processamento de pri-miRNA
- Transcrição: codificação em íntrons por RNA pol II.
- Pri-miRNA (primary miRNA): transcrito do gene de miRNA; centenas a kb;
- Processamento de pri-miRNA:
	- Adição de 5’-CAP e 3’-poli(A);
	- Pode ter splicing;
	- Estrutura em stem-loop (hairpin).
2) Liberação do pré-miRNA
- Processamento do pri-miRNA no núcleo por complexo enzimático (microprocessor):
	- Drosha (RNAse III): cliva o stem-loop >> gera o pré-miRNA;
		- Local de clivagem: mede a distância da junção RNA fita simples/dupla.
	- DGCR8/Pasha: ptn de ligação de dsRNA.
- Pré-miRNA: 70nt; mantém a estrutura de hairpin ou stem-loop;
	- Overhang de 2nt em 3’.
Figura 3 (A). Síntese de miRNAs no núcleo.
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3) Transporte do pré-miRNA para o citoplasma
- Transporte ativo de pré-miRNAs >> exportina 5;
- RNA transcrito no núcleo é exportado como complexo RNA-ptns (RNAP).
	- Sinais de exportação presentes nas ptns;
	- No citoplasma, exportina libera a “carga” e volta ao núcleo para outro processo de exportação.
4) Processamento para formação do duplex
- Dicer (RNAse III): processa o pré-miRNA para formar o duplex maduro (~22nt; duas fitas de RNA aneladas);
- Interage com ptn de ligação (dsRBD): TRBP/Loquacius/PACT
5) Incorporação em RISC
- TRBP recruta a ptn Ago2 e, junto com Dicer forma estrutura trimérica >> início da montagem do complexo RISC (RNA-induced silencing complex);
- Uma das fitas (guide) é incorporada ao RISC; a outra fita (passenger) é degradada.
- Complementariedade da fita guide com mRNA alvo é parcial: não há clivagem do mRNA.
Figura 3 (B). Transporte do miRNA ao citoplasma e maturação.�
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Regulação da expressão de genes alvos por miRNAs
* Local de atuação dos miRNAs+RISC: região 3’-UTR após ORF que codifica a ptn, no mRNA;
- Degradação ocorre em Processing Bodies: clusters de ptns associadas com inibição da tradução, silenciamento gênico e decaimento de mRNA, incluindo a maquinaria para retirada do capacete e a exonuclease XRN1.
	- Considerada região de acúmulo de mRNA não traduzidos, assim como ptns associadas, e de RNA regulatórios >> decisão sobre o destino final deste material. 
* Efeitos geralmente inibitórios (degradação do mRNA alvo >> silenciamento);
* Etapas:
1) miRNA (RNA regulatório) ligam enzimas aos ác. nucleicos que serão degradados, via pareamento de bases >> ptn Argonauta;
2) miRNA guia ptn Argonauta até o mRNA alvo a ser degradado. 
* Mecanismos de interferência de RNA:
- Normalmente: mRNA não reprimido recruta fatores de iniciação para início da tradução;
- Interferência:
1) miRISC se liga ao mRNA e reprime iniciação na fase de reconhecimento do CAP;
2) miRISC inibe iniciação
no recrutamento de 60S;
3) miRISC induz deadelinação do mRNA, impedindo sua circularização;
4) miRISC reprime o estágio de pós-iniciação da tradução, induzindo a saída prematura do ribossomo (dropoff);
5) miRISC promove degradação do mRNA, induzindo deadenilação e retirado do CAP.
Doenças e potencial terapêutico de miRNAs
* miRNAs: desregulados em várias doenças;
- Alvos potenciais para diagnóstico e tratamento (lesões, distúrbios degenerativos, inflamação);
	- pequenos inibidores de miRNA podem regular sua expressão a nível transcricional;
	- Oligonucleotídeos com sítios complementares a miRNA podem “sugar” miRNAs endógenos, caindo a expressão de miRNAS oncogênicos.
- Amplas pesquisas quanto a distúrbios neurológicos (ex. doença de Alzheimer) e cânceres.
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siRNAs Sintéticos
Aspectos gerais de siRNAs:
* dsRNAs curtos; excisados de um dsRNA longo, totalmente complementar;
* Função: defesa da integridade genômica em resposta a ác. nucleicos;
* Patogênese e terapêutica de doenças: câncer e doenças neurológicas.
* Assemelha-se a miRNA:
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Figura 4 (A). Via de síntese de processamento de miRNA. (Jinek et al, 2009. A three-dimensional view of the molecular machinery of RNA interference.)
Figura 4(B). Via de síntese e processamento de siRNA.�
- Identificação do RNA alvo a ser silenciado: especificada pela composição do RNA curto >> pareamento de bases do RNA curto + RNA alvo;
- Dependência de famílias de ptns:
	- Dicer: excisão do RNA curto de seu precursor;
	- Ptns Argonauta: efetoras do silenciamento gênico.
- Síntese do RNA é rapidamente reprogramável:
	- Caso haja mudanças no ambiente celular: aumento da expressão de novos RNAs curtos; os velhos são degradados;
	- Em uma invasão viral: sequências exógenas são utilizadas para os mecanismos de RNAi como defesa celular.
Atuação do siRNA
* Parecida com a do miRNA;
* Dicer: cliva dsRNA ~21-25nt;
* TRBP: ptn de ligação de dsRNA;
* Ago2:
- Cliva e ejeta a fita passenger;
- Usa fita guide para localizar mRNA alvo e faz sua clivagem, a partir da hidrólise de ligações fosfodiéster do mRNA alvo;
- RISC cliva o mRNA na metade da seq. complementar (10nt upstream do nt do mRNA pareado com a terminação 5’ da fita guide);
	- Clivagem não requer ATP, mas ATP aumenta eficiência em múltiplos rounds de clivagem.
- Reciclagem de RISC.�
Argonauta
* Possui dois domínios: 
- Paz: liga-se em 3’ no overhang do duplex siRNA;�
- Piwi: atividade de clivagem (endonuclease)
	- No complexo RISC, também há outra ptns com atividade de endonucleases específicas para fita dupla.
	
Figura 5. Exemplificação da clivagem do complexo Ago2-siRNA duplex. (Pratt et al, 2009. The RNA-induced silencing complex: a versatile gene-silencing machine.)
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Degradação de siRNA: também ocorre em P bodies. 
Efeitos finais da RNAi:
* Prejuízos na tradução/estabilidade do mRNA alvo;
* Clivagem do mRNA alvo.
* Efeito final depende do Tipo de RISC e grau de complementariedade:
- RISC que não cliva: tanto faz a complementariedade (perfeita ou não) >> repressão >> P body
- RISC que cliva (miRNA/siRNA): dependendo da Ago com o tipo de RNA, ou cliva ou não cliva. 
Figura 6. Efeito final em relação ao tipo de RISC e grau de complementaridade. (Tang, 2005. siRNA and miRNA: na insight into RISCs.)
Aplicações de RNAi
* Verificar função de genes por genética reversa (knockdown);
- Genes causadores de doenças genéticas; expressão gênica >> fenótipos celulares;
- Alto potencial na terapêutica de doenças (ex. câncer e doença de Parkinson).
* Interações entre proteínas em vias celulares.
Trabalhando com RNAi:
1) Encontrar a sequência-alvo de RNAi;
2) siRNA sintéticos comerciais >> seleção de alvos;
3) Utilizar vetores de expressão, caso o interesse seja em efeitos prolongados;
- Agentes lipídicos; eletroporação.
4) Trabalho inicial: céls em cultura;
5) Utilizar modelos animais para testes de efetividade de RNAi.
Vetores de expressão
Biotecnologia molecular: manipulação do DNA
* Tecnologia do DNA recombinante (TDR):
- Digestão do DNA por enzimas de restrição;
- Clonagem;
- Transformação bacteriana;
- Sequenciamento de um fragmento de DNA;
- Hibridização de ácidos nucleicos.
* Plasmídeos
- Sequência de DNA circular; podem carregar genes de resistência;
- Em bactérias: auto-replicação
	- Independente da divisão celular;
	- Utiliza maquinaria da cél hospedeira.
* Vetor de clonagem: pode ser inserido uma outra moléc de DNA, sem prejuízo à sua capacidade de replicação. 
- Possui ORFs, sítios de restrição; 
- Uma única marca de seleção: gene de resistência de E. coli
* Vetor de expressão: sistema genético para expressão de sequências de RNAs de interesse, como RNAs codantes e RNAs regulatórios.
- Possui ORFs, sítios de restrição;
- Duas marcas de seleção: gene de resistência de E. coli e outro de resistência no sistema de expressão/cél hospedeira;
- Promotor de expressão: de acordo com o sistema de expressão.
Tipos básicos de vetor de expressão:
* Viral >> vírus infecta célula, que expressa sequência nucleotídica desejada.
- Mais comuns: parvovírus (AAV), adenovírus, herpesvírus, retrovírus. 
	Vetor viral
	Vantagens
	Desvantagens
	Solução
	Adenovírus
	Fácil de manipular;
	Patogênico;
	Deleção dos genes que codificam as ptns patogênicas; adição do transgene e inserção do DNA do hospedeiro. 
	
	Bom promotor de transdução de céls;
	Resposta imune faz com que dosagens múltiplas fiquem ineficazes.
	
	
	Possui receptor CAR (comum em várias céls).
	
	
	Retrovírus (Oncoretrovírus e Lentivírus)
	Integração no genoma celular;
	Dificuldades na manipulação;
	
	
	Longa expressão.
	Não infecta céls que não estão se dividindo;
	
	
	
	Ativador de oncogenes.
	
	Parvovírus
	Integração no genoma celular em cromossomo específico (19);
	Integração no DNA de céls hospedeiras pode causar dano.
	
	
	Inserção de pequenos genes.
	Rearranjos e deleções genômicas adicionais.
	
	Herpesvírus
	Fácil de manipular;
	Patogênico.
	
	
	Persistência em céls neuronais sem integração.
	
	
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* Não-viral: plasmídeo >> promotor de expressão + acessórios para clonagem (ORF, sítios de restrição, marca de seleção)
- Desenho de vetores de expressão para escolher o promotor;
- Fatores de transcrição
- Promotores distintos para cada RNApol 
	- para RNApol III: transcreve tRNA, rRNA 5S >> RNAi - shRNA
		- U6: requer TATAbox, PSE e DSE (proximal/distal sequence element)
			- snRNA U6: envolvido no processamento do RNA >> splicing: parte do spliceossomo, agregado a ptns
		- H1: promotor do gene do RNA H1 humano, que codifica o RNA componente da RNAse P. 
			- RNAse P: enzima que cliva precursores do tRNA para produzir terminação 5’ madura. 
Obs.: Porque se usam U6 e H1 em vetores?
- Iniciação: promotor da classe III; upstream da região transcrita (útil para siRNAs ou shRNA)
	- Classes I (5S RNA) e II (tRNA): promotor dentro da região transcrita.
- Terminação: U6 e H1 possuem sequências conservadas/sítios de ligação de fatores.
	- para RNApol II: transcreve mRNA >> miRNAs
		- CMV
		- Genes específicos
Clonagem em vetores de expressão
* Clonagem molecular: isolamento e propagação de molécs idênticas de DNA.
- Possibilita maior produção de quantidade do DNA de interesse;
- Sequenciamento e construção de bibliotecas genômicas. 
* Etapas:
1) Digestão: Uso de enzimas de restrição (enz. bacterianas que reconhecem sequências curtas de DNA como alvos e clivam a dupla fita).
- Reconhecimento de sequências específicas (4 a 7 nt: sítios de reconhecimento e restrição);
- Clivagem do DNA em regiões do grupamento fosfato.
	- Clivagem de extremidade cega; abrupta;
	- Clivagem de extremidade coesiva.
2) Ligação inserto-vetor:
- Deve-se levar em conta: relação das [molares] inserto-vetor; t e T de incubação da ligação;
ligase; pureza do DNA do inserto e do vetor.
	- Extremidades clivadas devem ser religadas
3) Transformação: introdução de DNA livre e purificado dentro de uma cél bacteriana;
- Cél bacteriana deve estar competente (capaz de ser transformada)
	- Transformação por choque térmico: desequilíbrio térmico entre os meios intra/extracelular auxilia na captação do DNA pela zona de adesão.
- Porque se usa E. coli?
	- Simplicidade genética e genoma sequenciado;
	- Taxa de crescimento;
	- Habilidade de hospedar DNA exógeno e ser sensível à ampicilina.
Pontos a considerar sobre vetores: 
* Grau de tecnificação;
* Controle dos efeitos de silenciamento;
- Tecido-específicos (escolha do promotor);
- Induzidos por fármacos.
* Aumento da duração do silenciamento (se for necessário);
* Queda da eficiência de transfecção que siRNA requer na passagem da membrana nuclear;
* Efeitos colaterais: inflamação, toxicidade, saturação das vias de RNAi.
Nanobiotecnologia
Primeiros conceitos:
* Nanociência: conhecimento sobre materiais em nanoescala.
* Nanotecnologia: exploração dessas propriedades em nanoescala para ter controle de estruturas e dispositivos em nível atômico, molecular e supramolecular, e compreender como fabricar e utilizar essas estruturas.
- Intensa utilização em farmacologia:
	- Solubilidade dos fármacos;
	- Queda de lesão tecidual;
	- Evita degradação do fármaco;
	- Aumenta seletividade para os tecidos alvos;
	- Queda de toxicidade:
- No geral: Nanotech pode drasticamente diminuir efeitos colaterais e aumentar a eficiência do fármaco. 
Nanopartículas: veiculam fármacos
* Nanopartículas lipossomais: microvesícula composta de bicamadas lipídicas que circundam o compartimento interior aquoso.
- Possui várias conformações (lamelar, micelar, inverso, multi).
- Possibilita transporte de fármacos:
	- Lipossolúveis: bicamada lipídica;
	- Hidrossolúveis: compartimento aquoso;
	- Intermediários: ambos os locais.
- Interação do lipossoma com a célula:
1) Absorção pela cél;
2) Liberação do fármaco no interior da cél ou proximidades;
3) Endocitose >> principal via: degradação de ~95% do que conseguiu entrar na célula.
Figura 7. Interação lipossoma-célula. (Torchilin, 2005. Recent advances of liposomes as pharmaceutical carriers.)
- Tipos de lipossomas:
	- Convencional;
	- Longa circulação;
	- Vetorizados;
	- Catiônicos.
Figura 8. Tipos de lipossomas e suas características. 
* Nanopartículas poliméricas (PLGA): polimerização de pequenas unidades
- Biocompatível: hidrólise libera dois compostos metabolizáveis (ác. lático e glicólico), de forma sustentada (liberação aos poucos);
- Não-tóxico; seguro.
* Outras nanopartículas: nanoesferas metálicas; nanotubos; nanopartículas cerâmicas. 
Desafios para as nanopartículas
* Vetorização: 
- Pode haver degradação tanto na administração local (oral, outras rotas mucosas) como parenteral (intravenoso, intratumoral);
- Pode haver resposta imune;
- Problemas na diluição.
* Nanopartículas para o transporte de siRNAs:
- SNALP: nanocarreadores lipídicos
	- Possui bicamada de lipídios catiônicos (carregamento de ác. nucleico) e lipídios helper (escape endossomal);
	- PEG: confere exterior hidrofílico para maior estabilidade e passagem de barreiras.
- CDP: nanocarreadores poliméricos
	- Polímero catiônico; matriz de ciclodextrina com decoração de adamantina e transferrina;
	- Ultrapassa barreiras; é pequeno >> queda na toxicidade;
	- Recoberta por grupos funcionais de imidazol >> escape de vesículas endocíticas.