Co_CC_81pia_20de_20P2_20Controle_20Microbiolo_CC_81gico pdf

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Isolamento de Listeria monocytogeneses 
Introdução 
→ Família listeriaceae, Listeria monocytogenes é a espécie de importância, por ser um microrganismo 
emergente, isolada em alimentos de origem animal e envolvida em surtos atuais 
→ Crescimento intracelular: mais difícil tratamento, sendo invasivo, apresentando sintomas e 
patogenicidade mais críticos (principalmente para os grupos de risco). Os grupos de risco são 
imunodeprimidos, idosos, crianças e gestantes 
→ Padrão na atual legislação: antigo era ausência, hoje é até 100 UFCs em determinados alimentos, porém 
os alimentos destinados para grupo de risco ainda é ausência 
→ A pasteurização do leite é o suficiente para eliminação da bactéria 
 
Características 
→ Características morfotintoriais: bastonetes gram + flagelados 
→ Características fisiológicas são muito sensíveis a temperaturas elevadas. Podem crescer de temperatura 
baixas até 49, podendo se desenvolver em temperatura de geladeira e durante o congelamento 
sobrevivem, sendo psicotroficos. Se for feito o tratamento térmico adequado ele se invibializa. Tolera sal até 
10%. Em relação ao pH, precisa estar acima de 4,4 e até 9, o seu pH ótimo é em torno de 7. É um dos 
poucos microrganismos patogênicos que conseguem sobreviver em atividade de água em torno de 0,92. 
→ Características epidemiológicas: 
● Histórico: a importância do estudo desse microrganismo é causar enfermidades vinculadas a 
alimentos que podem ser autolimitantes (geralmente) ou levar a quadros graves em 
imunocomprometidos e causar óbito. Na década de 70, a microbiologia de alimentos se 
desenvolveu muito por conta das novas biotecnologias (genética, microscopia). Na década de 80, a 
listeriose causou transtorno severos a muitas populações e isso junto os avanços da década de 70 
levaram a maiores estudos e informações sobre esse microrganismos 
● Está presente nos mais diferentes ambientes e animais (até inseto, peixes e anfíbios tem), tem 
distribuição cosmopolita. A contaminação se dá através de alimentos contaminados, como laticínios, 
produtos cárneos e vegetais. Nos animais habitam o trato gastrointestinal 
● Pode causar duas síndromes (se apresentam de duas formas nos hospedeiros): 
○ Gastrointestinal: ocorre pela colonização do TGI pela bactéria, possui período de incubação 
de 8 a 16h e após a pessoa tem enjoo, mal estar, vômitos e diarreia. Transmissão se dá pelo 
consumo de alimentos que não foram tratados termicamente ou que são consumidos crus 
○ Forma invasiva: é rara e muito grave, que ocorre quando a bactéria ultrapasse a barreira 
intestinal e realize bacteremia, atingindo diferentes órgãos (e assim, se transforma na forma 
invasiva). Pessoas saudáveis dificilmente desenvolvem a forma invasiva 
● Sinais clínicos: depende do órgão acometido que o MO vai se instalar e estado de saúde da pessoa 
○ Em mulheres grávidas pode provocar aborto, feto natimorto ou nascimento pré maturo 
(nesse caso o feto pode ter lesões serias). Sendo portanto, uma infecção bastante 
preocupante, quando não leva ao óbito pode ter lesões sérias no recém-nascido. 
○ Em idosos ou imunocomprometidos pode causar meningite 
● Prevenção: considerando as consequências da listeriose, percebemos a importância da prevenção, 
que se da por meio de alimentos seguros, tratados termicamente (embutidos, produtos lácteos, 
cárneos). A presença desse microrganismos não altera nem odor e nem sabor do alimento O 
tratamento é com base em antibioticoterapia 
 
 
Padrão microbiológico 
→ Alimentos pronto para consumo (APC): n=5; c=1, m=102 
→ Alimentos para lactantes vão ter n=10, c=0, m = ausente 
→ Meios de cultura básicos: devem ter a capacidade de recuperar concentrações baixas de microrganismos 
como 100 unidades por grama ou ml de alimento. Os meios analíticos devem ser finos e sensíveis para 
recuperar esses microrganismos injuriados (sofre dano fisiológico, mas não morre, logo está viva e não 
cultivável) ou em baixas concentrações. Tem uma etapa de cultivo em meio líquido não seletivo para 
enriquecimento e depois, os meios que cresceram (apresentaram turbidez), passam para cultivo em placa 
em meios muito seletivos, após isolada a colônia vai para análises nas provas bioquímicas. Também é 
possível isolar a partir de amostras de sangue do paciente em casos de bacteriemia 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Isolamento de Clostridium perfringens 
Introdução 
→ Pode desencadear três processos nocivos aos seres humanos: infecção alimentar, enterite necrótica e 
gangrena gasosa 
→ Está entre os cinco microrganismos mais frequentes em intoxicações alimentares, veiculados por carnes 
bovinas e frango - principalmente em peças maiores, geralmente em ambientes festivos com volume maior 
de alimentos (que cria ambiente de anaerobiose, reduz a troca de O2 com ambiente e temperatura não foi 
suficiente para eliminar os esporos) 
 
Características 
→ Características morfotintoriais: bastonetes gram +, imóveis, capazes de produzir esporos, o que torna 
esse microrganismo muito resistente a temperatura elevada 
→ Características fisiológicas: temperatura de 43 a 45°C (termófila); anaeróbio; formador de esporos: 
posição do esporo no esporângio é terminal (diferente do B. cereus); germinação ocorre quando é 
submetida à choque/estresse térmico (aquecimento), passam de esporo para a forma vegetativa; pH ótimo 
de 6 a 7, faixa de crescimento de 5 a 9; reprodução rápida e criptobiótico (capaz de se reproduzir desde que 
as condições estejam favoráveis); 
 → Características ecológicas: ampla distribuição ambiental: a carga inicial no alimento deve ser a menor 
possível - é necessário higiene no processamento; capaz de sobreviver por muito tempo no solo 
→ Características gerais: são classificados de acordo com seus sorotipos, os quais são denominados de 
acordo com o tipo de enterotoxina que produzem = é um fator de agressão, pode produzir as toxinas A, B, 
C, D, E e F, sendo a A a mais preocupante (CPE), quanto a enterite necrótica o tipo C é o mais preocupante 
 
Patogênese 
→ Sorotipo A: a forma vegetativa é ingerida e chega ao intestino delgado, onde produz toxina em seu 
interior e, depois, rompe o esporângio, liberando-a (causa infecção). Essa toxina penetra e adere na 
membrana citoplasmática da célula da vilosidade intestinal, alterando sua permeabilidade seletiva 
formando poros, o que leva ao quadro de diarreias e desequilíbrio hidroeletrolítico, cólicas e dor 
abdominal. Seu período de incubação é de 8-16h após o consumo nado, é uma típica infecção alimentar e 
causa doença autolimitante (sintomas duram em torno de 24h) sem grandes repercussões 
 
Padrão microbiológico → n = 5; c = 1; m = 10²; M = 10³, costumam causar doença quando há > 10⁶ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Isolamento de Staphylococcus Coagulase positivo 
Introdução 
→ Ênfase dada ao grupo Staphylococcus Aureus, é um importante desencadeador de intoxicação 
alimentar, uma das mais frequentes causadoras de infecções alimentares no planeta como todo 
(classificada como categoria 3 = moderada agressão com evolução autolimitante, mas gera desconfortos 
significativos). A bacteremia pode gerar osteomielite, meningite, endocardite, conferindo um alto grau de 
mortalidade. Os grandes veiculadores são manipuladores de alimentos com feridas de pele ou portadores 
assintomáticos. Essas bactérias estão cada vez mais resistentes à microbianos e adaptadas 
→ Epidemiologia: os alimentos mais envolvidos são produtos lácteos (leite, creme de leite, manteiga) e 
cárneos (frango, presunto). Em processados, indicam problemas de higiene, manipulação, sanitização e 
temperaturas. Em crus, relacionados a animais doentes (mastite) e contaminações humanas (manipulação) 
 
Características 
→ Características morfotintoriais: cocos gram + (forma de cacho de uva), não formam esporos (em 
processos de pasteurização são sensíveis a altas temperaturas e podem ser inativadas, mas a sua 
enterotoxina não é), imóveis, anaeróbios facultativos, catalase + e oxidase - 
→ Característicasfisiológicas: temperatura de 35-37°C (mesofílicos); capaz de se desenvolver na 
presença de NaCl (sal) 5-10% (meio manitol salgado pode ser utilizado, mas cresce na ausência também); 
capaz de crescer com atividade de água baixa (diferente da maioria dos microrganismos - Aw 0,99-0,83); 
pH ótimo de 7-7,5, mas pode ir de 4,7 até 9,3; aeróbios ou anaeróbios facultativos (nunca será anaeróbio) 
ou até microaeróbios 
→ Características ecológicas: o reservatório importante é o ser humano (portador sintomático ou 
assintomático) pela manipulação de alimentos. Presente no trato respiratório superior (narinas) de 60% da 
população (em condições normais não causa doença); pode estar presente no solo e água 
 
Patogênese 
→ Intoxicação provocada pela ingestão do alimento contendo a enterotoxina pré formada // Período de 
incubação: de 30 min até no máximo 7h 
→ Sintomas: náusea, vômito, diarréia, dor abdominal,, raramente é fatal. O tratamento geralmente é 
sintomático, com foco na hidratação // Higiene: manuseio de alimentos com as mãos limpas e luvas 
 
Metodologia analítica 
→ Diluição e plaqueamento: transfere 0,1 mL de alíquota no centro e espalhar com bastão de hockey, 
fazendo semeadura por superfície (pour plate) no meio de cultura Agar Baird Parker (que possui 
características que impedem outros microorganismo de crescer) adicionado de emulsão de gema, que 
permite tanto o crescimento e como a visualização da atividade lipolítica e proteolítica (aparecimento de 
halo de transparência na proteólise e precipitação ao redor da colônia na lipólise) e de telureto de potássio 
(confere coloração negra da colônia). Então, ocorre a incubação a 37°C por 24h das placas invertidas 
→ Colônia característica enegrecida com halo esbranquiçado de precipitação e halo transparente 
→ Teste da coagulase: transfere 0,3 mL de cada tubo com BHI para tubos estéreis contendo 0,3 mL 
de plasma de coelho e ocorre a incubação de 35-37°C por 24, para verificar presença de coágulos 
● Reação -: sem coágulo / Reação +: formação de grumos, se desprendem caso o tubo seja invertido 
ANOTAR ESSA PARTE DE REACAO DO resumo 
Padrão microbiológico → n = 5; c = 1; m = 10²; M = 10³ 
 
 
Enumeração e Identificação de Bacillus cereus 
Introdução 
→ É um microrganismo com capacidade de formar biofilme, é proteolítico, tem 
capacidade de formar esporos, possuindo grande importância na indústria 
→ Taxonomia é dificultada pela elevada heterogeneidade nas característica genotípicas e 
fenotípicas, logo a nomenclatura Bacillus cereus corresponde a um grupo latu sensus 
→ Epidemiologia: o solo é seu reservatório natural, é uma causa conhecida de mastite, 
especialmente em ovelhas e novilhas. Causa infecções oculares, abscessos, meningite, 
septicemia e infecção de feridas 
 
Importância na indústria de alimentos 
→ Problema sério nas indústrias devido a sua capacidade de formar esporos termoresistentes, os quais 
são resistentes ao calor e podem se aderir fortemente a superfícies, incluindo aço inoxidável 
→ Formação de biofilme é extremamente resistente, em que se forma uma película contendo inúmeros 
microrganismos. Suas características de hidrofobicidade e presença de filamentos tornam sua remoção 
muito difícil. Isso é um ponto crítico na indústria de leite, na qual o problema são as tubulações, que são de 
difícil limpeza, podendo, assim, ter a formação de biofilmes. A água não dissolve o biofilme, por isso, 
deve-se ter um controle permanente, não se deve deixar chegar nessa situação. É preciso fazer uma 
pesquisa sistemática para saber se está tendo algum problema na matéria-prima 
→ Gera defeitos no leite UHT: de sabor, amargor do creme, coagulação e ação de lipases, fosfolipases e 
proteinases secretadas pelo B. cereus. É um MO proteolítico e o leite é composto de água e proteína 
→ Uma larga variedade de alimentos tem sido associada em surtos, tais como carnes, leite, peixes, arroz, 
batatas, massas, queijos, misturas com molhos, pudins, sopas, assados e saladas - não tem um específico 
→ Mediadas de controle: tratamento térmico adequado, manutenção da temperatura acima de 65ºC depois 
do alimento pronto, resfriamento rápido para armazenar 
 
Características 
→ Características morfotintoriais: bastonetes gram + delgados e em cadeia; formadores de esporos 
(centrais ou subterminais), característica extremamente importante pois sobrevivem a pasteurização 
(termoduricos); aeróbios (difernete de Clostridium que é anaerobio) 
→ Características fisiológicas: temperatura de10 a 48°C (a ótima é de 30-35°C); pH amplo (4,9 - 9,3); 
flagelos peritríqueos (confere alta mobilidade e fixação), logo são móveis (90%) 
 
Patogenia 
→ Toxinfecção relacionada à ocorrência de uma síndrome emética é causada pela ingestão da toxina 
pré-formada, tendo período de incubação de 30min a 6h. E na síndrome diarreica ocorre a ingestão do 
microrganismo (toxina produzida no intestino delgado), tendo período de incubação de 8 a 24h 
→ A toxina responsável pela síndrome emética é a cereulida, que é termoestável (resiste a mais de 30 min 
a 121°C), é resistente à proteólise (insensibilidade à tripsina e à pepsina), estável em pH entre 2 e 11 e 
sintetizada entre 25 e 30°C. Os vômitos aparecem logo após a ingestão dos alimentos contaminados. Dada 
a sua resistência, a toxina emética não é destruída pelo cozimento ou por enzimas digestivas 
→ A toxina responsável pela síndrome diarreica é a toxina HBL, que é termorresistente, hemolítica, 
dermonecrótica e aumenta a permeabilidade dos capilares, provocando acúmulo de líquidos (em algumas 
situações pode chegar a ter desidratação) 
 
 
→ É preciso ter contagens entre 105 e 107 UFC/g (alta) para gerar sintomas da doença. A produção da 
toxina ocorre na fase logarítmica (Log) de crescimento e/ou esporulação 
 
Isolamento e identificação 
→ A contagem baseia-se na inoculação de diluições sob teste em ágar polimixina gema de ovo vermelho 
de fenol (MYP) ou em ágar cereus (PEMBA). A polimixina B é um agente seletivo utilizado nos dois meios, 
que atua sobre a flora acompanhante, ambos contêm manitol (B. cereus não fermenta manitol), ou seja, o 
vermelho de fenol não é ativado. A gema de ovo dá o fornecimento da lecitina, que é quebrada, formando 
um halo ao redor 
 Enumerá-los é muito complicado, pois são móveis, mas geralmente há UFCs que podem ser contadas. 
Ele vai se desenvolvendo e se espalhando até formar uma massa, a identificação é simples e fácil. Um caso 
grave especialmente na indústria de laticínios 
→ Provas bioquímicas: observa formação de β-hemolisina, motilidade em meio semisólido, capacidade de 
decomposição da tirosina, redução do nitrato a nitrito, tipo de crescimento em superfície de ágar nutriente 
 
Inoculação 
 → Procedimento: inclui a pesagem e preparo da amostra, pesando de 25 ± 0,2g da amostra e adicionar 
225mL de solução salina peptonada 0,1%. Após, homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em 
“stomacher”. Essa é a diluição 10-1 na proporção de 1:10. Realiza-se semeadura por superfície 
→ Emulsão de gema: é adicionada para observar proteólise (halo de transparência) e lipólise (halo de 
precipitação, deixa o pH mais básico, deixando colônias azuladas no aga PEMBA e o MYP fica rosa s/a) 
→ Ágar PEMBA: bacilos produzem a lecitinase, que hidrolisa a lecitina, gerando colônias azuis com zonas 
de precipitado branco ao redor delas. Detecta pequena quantidade de B. cereus na presença de grande 
quantidade de contaminantes Se hidrolisar e ficar azul é B. cereus, se ficar amarelo é S. aureus (FOTO) 
→ Ágar MYP: a partir da diluição inicial 10-1 deve-se efetuar as diluições desejadas. Inocular sobre a 
superfície seca do ágar MYP 0,1mL de cada diluição selecionada. Com auxílio de alça de Drigalski ou bastão 
tipo “hockey”, espalhar o inóculo cuidadosamente por toda a superfície do meio até completa absorção 
(semeadura em superfície). Geram colônias rosas e lecitinase positivas. Visualiza na placa UFC espalhada 
(móvel) e forma um halo claro (opaco) de lipólise e outro mais claro(transparente) ao redor (proteólise) 
→ Incubam-se as placas invertidas a 30 ± 1°C por 30 a 48 horas. Para leitura, selecionam-se placas que 
contenham entre 15 e 150 colônias. Deve-se contar as colônias rodeadas por um halo de precipitação 
opaco sobre um fundo róseo, no ágar MYP. Depois, seleciona-se de 3 a 5 colônias típicas que serão 
semeadas em tubos com ágar nutriente inclinado (que irá permitir a realização de provas bioquímica e 
classificação de B. cereus presuntivas dependendo dos resultados), sendo incubadas 36 ± 1°C por 24 
horas. Das colônias selecionadas no tubo, fazer esfregaço e corar pela técnica de Gram para verificar a 
presença de bastonetes curtos Gram positivos, com extremidades quadradas dispostos em cadeias. O 
resultado se dá a partir do cálculo do número de B. cereus multiplicando o número de colônias confirmadas, 
nas provas confirmativas, pelo fator de diluição usado (expressar o resultado em UFC/g ou mL) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Identificação bioquímica 
→ Hidrólise da gelatina (+): é extremamente simples, o objetivo é saber se a suspeita de B. cereus produz 
ou não a gelatinase (hidrolisa a gelatina em aminoácidos). Se a degradação ocorre, não se consegue 
restaurar as características de gel da gelatina, mesmo a baixas temperaturas, ficando líquido. Inocula-se por 
picada (agulha) um meio de cultura gelatina e incuba-se a 37°C durante 24 a 48h. Nesse processo, a 
gelatina ficará líquida. Depois, as culturas são colocadas em geladeira a 4°C durante 30min. Se o 
microrganismo produzir gelatinase, quando a cultura for colocada na geladeira e não solidificar, o resultado 
será gelatinase positiva. Ou seja, a reação é positiva quando a gelatina é hidrolisada pela gelatinase, 
assim, o meio se mantém líquido após refrigeração. Se o microrganismo não possui gelatinase, o meio 
resolidifica durante o período em que está na geladeira, ou seja, a reação é negativa 
→ Motilidade e redução de nitrato: inocular com agulha tubos contendo ágar motilidade-nitrato e 
incubar a 36 ± 1°C por 18 a 24 horas. Após, observar o tipo de crescimento presente. Se crescer 
apenas ao longo da picada (crescimento apenas na linha de inoculação), o microrganismo não é 
móvel, se crescer de forma difusa o microrganismo é móvel. Após a leitura da motilidade, deve-se 
adicionar aos tubos 2 a 3 gotas de alfa naftilamina 0,5% e 2 a 3 gotas de ácido sulfanílico 0,8%. O 
aparecimento de coloração rosa indica positividade para redução de nitrato (B. cereus reduz o 
nitrato a nitrito) Sugere-se fazer a picada e estrias na superfície para observar logo a reação do 
alfa naftilamina e do ácido sulfanílico na superfície 
→ β-hemólise em ágar sangue de carneiro: não é muito realizada no laboratório, mas, nessa técnica, 
inocula-se por estria em placa com ágar sangue de carneiro. Incubar a 36 ± 1°C por 24 horas e, após, 
observar a produção de β-hemólise (característica do B. cereus) 
→ Decomposição da tirosina: inocular por estrias a superfícies de ágar tirosina (inclinado em tubo ou 
distribuído em placas), incubar a 36 ± 1°C por 48 horas. Após incubação, observar o aparecimento de 
uma zona clara próxima ao crescimento produzida pela decomposição da tirosina. Nos casos em que 
houver dúvidas, reincubar por até 7 dias a 36 ± 1°C. Observa-se o resultado de 2 formas: o meio de cultura 
mudando de cor ou formação de halo ao redor indica decomposição da tirosina (positivo) Prof não gosta 
→ Crescimento rizóide: inocular com alça sobre a superfície de ágar nutriente, depositando o inóculo no 
ponto central da placa. Incubar a 36 ± 1°C por 48 a 72 horas e verificar o tipo de crescimento. Crescimento 
rizoide é o aparecimento de colônias com longas extensões em forma de raízes/longos fios, típicas de 
Bacillus mycoides. O B. cereus não apresenta crescimento rizoide, porém, algumas cepas podem 
apresentar colônias rugosas em forma de galáxia (negativo para crescimento rizóide) 
 
Provas diferenciais para microrganismos do gênero Bacillus 
→ O grande problema que se tem na legislação com relação ao B. cereus 
é que após todas essas provas há apenas B. cereus presuntivo, pois todos 
esses resultados também são idênticos para B. thuringiensis. Apenas uma 
lâmina corada pela técnica da fucsina básica pode distingui-los, na qual 
observa-se corpúsculos no B. thuringiensis (tem reserva estrutural e 
energética = corpúsculos de inclusão cristalina) 
→ Teste para verificação da presença de corpúsculos de inclusão cristalina: a partir de culturas suspeitas 
repicadas em ágar estoque inclinado e deixadas em temperatura ambiente por 2 a 3 dias, verificar a 
presença de corpúsculos de inclusão cristalina (frequentemente usados como materiais de reserva 
energética ou reserva de materiais estruturais), B. cereus não produz corpúsculos de inclusão cristalina. A 
legislação antiga (2001) já afirmava que era B. cereus após resultado dos testes bioquímicos, mesmo sem 
fazer a técnica de coloração com fucsina básica. Em 2019 mudou, pois afirma que após essas provas o 
resultado é de B. cereus presuntivo, mas também não se pede para fazer a lâmina e diferenciar