P2 Controle Microbiologico

Prévia do material em texto

Controle Microbiológico de POA 
Isolamento e Identificação de Salmonella 
Introdução 
→ Salmonella spp. é um dos microrganismos mais envolvidos em surtos de origem alimentar ( junto à E. 
coli e Staphylococcus), pois têm cepas muito patogênicas. Apesar de não ser formadora de esporos (cél. 
de resistência bacteriana), ela tem capacidade de formar uma célula viável e não cultivável (CNV), capaz 
de se manter viável em ambientes que não são favoráveis - microorganismo fastidioso de difícil isolamento 
→ Microbiota autóctone é a acompanhante do alimento (que geralmente está numa concentração maior), 
já a Salmonella faz parte da microbiota contaminante, por isso costuma ser o microrganismo em menor 
quantidade, o que dificulta seu isolamento. Nas etapas de isolamento da Salmonella são feitos processos 
com o intuito de inibir o cresc da microbiota interferente/acompanhante para que a Salmonella possa 
crescer ⚠Questão de prova: se manter viável e não cultivável e ter microbiota autóctone 
→ Habitat: trato gastro-intestinal de homens e animais. Os reservatórios de Salmonella são as aves (é o 
principal reservatório, presente em carne e ovos), homens, suínos, répteis, mamíferos domésticos e 
silvestres. O homem inclusive pode se tornar um portador assintomático (elimina mas não desenvolve a 
doença, virando uma fonte de contaminação dentro da cadeia produtiva) ⚠Questão de prova 
→ A contaminação pode ser pelos poros da casca no momento da postura e na própria formação do ovo, 
ou do próprio trato intestinal no momento da evisceração - dentro da indústria pode causar danos para o 
consumidor final, por isso, é importante que a indústria tenha boas práticas de manipulação. Esse gênero 
está muito associado à questão da contaminação cruzada dentro da indústria ligada à falta de boas 
práticas ou na área de esfola, quando se tem o rompimento do TGI, contaminando a carcaça e o ambiente, 
logo, se não for feita limpeza adequada do ambiente e da faca utilizada, pode carrear o microrganismo. Um 
agravante é o fato de se ter portador assintomático, podendo estar na microbiota sem causar alterações no 
hospedeiro, facilitando a contaminação de alimentos 
Obs: Muito pessoas lavam o frango, espalhando Salmonella (se estiver presente) ou ao usarem a mesma 
faca que cortou o frango cru para cortar um frango pronto, legumes ou verduras. Outro problema é o uso de 
tábua de madeira ou colher de pau, que têm material poroso 
 
Características 
→ Família Enterobacteriaceae, bastonetes Gram negativos, não esporulados, oxidase negativa (não 
sintetizam a enzima oxidase, que faz com que o oxigênio seja usado como último receptor da cadeia de 
elétrons no metabolismo do microrganismo), a maioria são móveis (flagelos peritríquios ao longo da 
célula, exceto S. Gallinarum e S. Pullorum, que são consideradas imóveis - motilidade se torna um fator 
de virulência), anaeróbios facultativos 
→ Mesófilos: crescem em temperaturas de 7-49,5°C, e temperatura ótima de 35 a 37°C. São sensíveis a 
baixas temperaturas (ambientes hostis por exemplo), logo, é preciso colocar o Vi entre parênteses, indicando que a 
expressão antigênica pode estar constante ou não, mas a célula é capaz de produzir. Ou seja, se o sorotipo 
tiver (Vi), significa que ele é capaz de formar a cápsula, mas pode ou não expressar (geralmente, a célula vai 
expressar esse antígeno quando está em um momento de desconforto bacteriano) 
 
★ Antígenos Flagelares (H): 
→ Os antígenos flagelares conferem motilidade à célula bacteriana, a principal proteína é a flagelina 
(molécula que será sintetizada para dar origem ao flagelo), em que em sua formação sofre muitas 
alterações em termos de sequência de aminoácidos (mudança da ordem dos aminoácidos). Serão 
chamados de monofásicos quando são capazes de formar 1 flagelo (apresenta apenas uma fase) e 
bifásico quando são capazes de formar esse flagelo em fases diferentes (maioria das cepas tem variação 
de fases). São termolábeis (destruidos por calor) 
→ Por existirem diversos tipos, o H é suprimido da fórmula, sendo representados por letras minúsculas e 
números. São identificados tanto por letra como número de acordo com a sequência de aminoácidos, pois 
existem microrganismos que vão ser capazes de formar flagelos em situações diferentes 
● Fase 1: expresso por letras minúsculas (fase específico) - quando é monofásico 
● Fase 2: expresso por números (fase grupo) - quando é bifásico (maioria das cepas de Salmonella) 
 
Obs: Parênteses indicam a constância da expressão do gen e não qual é maior (principal) ou menor 
(secundário). Quando não há formação de cápsula nada é indicado (lembrar que se Vi estiver fora de 
parênteses indica que a formação é constante). A separação dos antígenos ocorre pelas vírgulas e tudo que 
for após os dois pontos será correspondente aos antígenos flagelares ⚠Questão de prova: 
 
Provas bioquímicas 
→ Oxidase e Lactose negativas, não produzem butilenoglicol (VP negativo), VM positivas, reduzem nitrato 
a nitrato. As principais provas para Salmonella: Fenilalanina desaminase negativas e Urease negativas - 
estudam a capacidade do MO em degradar a ureia e a fenilalanina, e a Salmonella não sintetiza a enzimas 
fenilalanina desaminase e urease, ambas as provas são negativas = durante a análise, é muito comum a 
Salmonella dar diagnóstico cruzado com o gênero Proteus, logo essas provas sã importantes pois permite 
a diferenciação (é positivo nas duas provas) ⚠Questão de prova: diferenciar Salmonella e Proteus 
Obs: O mais importante para se saber da bioquímica é que é Lac - e as principais provas (fenilalanina 
desaminase e urease) ⚠Questão de prova: 
 
 
Epidemiologia 
→ Locais de detecção: fezes, água, alimentos (habitat é o TI homem e animais), alimentos processados 
→ Salmoneloses de animais para humanos: Salmonella Enteritidis e S. Typhimurium (pandêmicos) 
→ Salmoneloses de humanos: S. Thyphi e S. Parathyphi (febres) - imunodeprimidos são grupo de risco 
→ Sorovares adaptados/restritos ao hospedeiro: S. Gallinarum (aves), S. Dublin (gado), S. Cholaraesuis 
(suíno), S. Abortusequi (equino), S. Abortusovis (ovinos) 
→ Aves migratórias podem ser portadoras assintomáticas, sendo grandes dispersores do microrganismo 
no ambiente através das fezes, gerando contaminação Busavalario 
→ Portador assintomático: >5% são portadores assintomáticos, que são um grande problema na indústria 
→ Doença dos 4 F's: finger (dedos - manipulador), food (alimento, principalmente dos principais tipos 
pandêmicos), fly (mosca) e faeces (fezes). Justamente por essa quantidade de reservatórios, a doença pode 
vir pelo homem, pela água, transportada por animais (questão da higiene) 
 
Transmissão 
→ Pode ocorrer de forma direta, por fontes residuais de água e esgoto e por alimentos processados 
→ Enfermidade de morbidade alta, mas a mortalidade é baixa (exceto para grupo de risco 
imunocomprometidos - doença muito associado à morte em pessoas com AIDS, principalmente pela baixa 
imunidade. Porém, no geral, a doença é autolimitante, causando problemas de gastroenterite forte 
→ Algumas cepas possuem multirresistência antimicrobiana e causam impacto socioeconômico muito 
grande, por estarem envolvidas em surtos de origem alimentar e, apesar de ser uma doença com curso 
autolimitante, pelos gastos hospitalares e com afastamento de funcionários 
→ A enfermidade pode ser classificada como sendo do tipo septicêmica, entérica ou assintomática: 
● Septicêmica: bactéria cai na circulação sanguínea e causa sintomas mais graves, podendo levar até 
à sepse. As principais são a S. Typhi e Paratyphi (febre tifoide e paratifoide). São sorotipos mais 
veiculados pela água, transmitidos de homem para homem, não de animal para o ser humano 
● Entérica: responsável pela Salmonelose, que causa uma gastroenterite, levando a diarreia, vômito 
e dores abdominais. As principais são a S. Typhimurium e S. Enteritidis 
● Assintomática: gera problemas na indústria, já que o homem pode veicular o microrganismo sem 
desenvolver a doença, sendo um ponto de contaminação da indústria 
→ A Salmonella pode causar infecção alimentar ou toxinfecção alimentar. Muitas cepas são capazes de 
produzir toxinas (enterotoxinas e citotoxinas), sendo sintetizadas já no trato intestinal, por isso chamamos 
de toxinfecção alimentar ⚠ Quando a toxina é pré-formada no alimento (como botulismo), a intoxicação é 
por alimentação, em que a ingestão da toxina pré-formada vai ocasionar a patologia. Quando a toxina é 
formada pelo microrganismo no TGI - pela célula viável que foi ingerida- o processo é chamado de 
toxinfecção 
→ Febre tifóide (S. Typhi): doença de natureza entérica e sistêmica, caindo na corrente circulatória e indo 
para outros órgãos, sendo os principais fígado e baço, as bactérias se multiplicam dentro das células 
fagocitárias. Pode evoluir para infecção generalizada, gerando septicemia, artrite séptica. Sintomas: febre 
alta contínua, dores abdominais e de cabeça, letargia, vômitos, diarreia ou constipação, perda de apetite, 
erupção cutânea 
→ Enterocolites (Salmoneloses): doença causada pelos sorotipos pandêmicos, acomete a luz intestinal 
(mucosa intestino delgado e cólon), tendo adesão e penetração no epitélio intestinal (lâmina própria). Se 
multiplicam e ocorre a internalização, ocasionando “arrepio” (ruffing) devido ao engolfamento de 
pseudópodes e à reação inflamatória causada por eles, produzindo enterotoxina e endotoxina (LPS). 
Geralmente é autolimitante (exceto grupo de risco), mas os sintomas incluem cólicas abdominais, náuseas, 
vômitos, diarreia, calafrio, cefaleia e febre (caso seja crônica pode ocasionar artrite também) 
 
 
Isolamento 
→ Para a maioria dos alimentos o padrão para Salmonella é ausência em 25g. Exceto para aves, em que, 
uma vez identificado em carcaças, deve-se partir para a pesquisa de sorotipos pandêmicos que são 
Typhimurium e Enteritidis, que devem estar ausentes 
→ A Salmonella é um microrganismo difícil de ser isolado por ser fastidioso, sendo difícil a recuperação 
da célula bacteriana fazendo com que ela expresse as características em meio de cultura, principalmente 
por estar em menor quantidade. Por causa disso, o isolamento é dividido em fases: 
Pré-enriquecimento ▶Enriquecimento seletivo ▶Plaqueamento seletivo ▶Triagem ▶Bioquímica 
 
★ Pré-enriquecimento: 
→ É a fase nutritiva, em que se entra com uma solução com objetivo de recuperar a célula bacteriana 
(injuriada, que sofreu lesão), utilizando um caldo nutritivo não seletivo = Água Peptonada Tamponada 
(APT - confere pH ideal), Caldo Lactosado, Caldo Manitol, Caldo Sorbitol, Caldo Triptonado, Caldo 
Peptonado. Não tem nenhum componente seletivo porque não se pode estressar a célula bacteriana (mais 
do que ela já está estressada). O alimento vem anteriormente de um processamento tecnológico, que já 
ocasiona lesões e injúrias na célula bacteriana, então, é preciso recuperar a bactéria dessa injúria, pois, se 
não, ela não se expressa no meio de cultura. Após 24h, amostra vai para a etapa de enriquecimento→ Pega-se a amostra em que se está pesquisando Salmonella, pesa 25g e depois coloca em 225mL de 
APT. A incubação é feita a 35-37°C (microrganismo mesófilo) por 18-24h. Se for positivo, espera-se que 
ela cresça, se desenvolva e se recupere das lesões e injurias sofridas, principalmente de membrana celular 
Obs: Como a bactéria está presente no alimento está em menor quantidade, não se faz diluições seriadas 
 
★ Enriquecimento seletivo: 
→ É a fase em que se entra com caldo nutritivo seletivo nos meios de cultura (Caldo Mossel, Rapapport 
Vassiliadis, Selenito-Cistina, Selenito e Tetrationato - não pergunta nome de meio na prova, mas tem que 
saber a importancia de cada etapa), que possui compostos que vão inibir a microbiota acompanhante 
(gram + principalmente) e favorecer o crescimento da Salmonella (seletividade). Trabalha-se sempre com 
dois meios de cultura diferentes para ampliar a chance de isolamento da Salmonella, para ver qual meio 
vai favorecer melhor o crescimento por ser fastidiosa 
→ Pega-se o caldo com 25g em 225mL de APT da fase anterior e começa a fase de enriquecimento 
seletivo. A incubação é feita a 35-37°C por 24h. Nessa segunda fase, opta-se sempre por trabalhar com 
dois caldos, saindo do pré-enriquecimento e semeando em dois tubos com caldos diferentes 
Obs: São dois meios de cultura diferentes porque é um microrganismo difícil de isolar e fastidioso, logo, o 
próprio componente antagônico de um caldo pode inibir a cepa de Salmonella. Por isso se trabalha com 
dois caldos, como Mossel e Rapapport Vassiliadis, para observar onde ela irá se adaptar melhor 
 
★ Plaqueamento seletivo: 
→ Observa-se se há suspeita de salmonella ou não, é a fase em que se trabalha com 2 ou 3 meios de 
cultura, dependendo da metodologia usada, dando mais chances para a Salmonella crescer. Os meios de 
cultura podem ser alta, média ou baixa seletividade: Alta: AVB; Bismuto Sulfito; XLD; Rambach; BPLS; Ágar 
XLT-4 (xilose-lisina-tergitol-4) // Média: Ágar S.S; Ágar Hektoen // Baixa: Ágar Mac Conkey; Ágar EMB 
Obs: Geralmente, pega-se um meio com alta, um com média e outro com baixa seletividade para criar 
condiceos mais favoreis para a multiplicação da bactéria e inibir a microbiota contaminante 
→ Semeadura por estria e esgotamento: pega-se os caldos e passa o microrganismo com auxílio de alça 
de platina para o meio de cultura, estriando nos quadrantes, com objetivo ter uma UFC isolada pura para 
estudar a bioquímica e chegar ao gênero e espécie. A incubação é feita a 35-37°C por 48h 
 
 
→ UFC típica de Salmonella: fica transparente e com o centro preto, pois produzem H2S (meios de cultura 
vão ter sulfato ferroso e citrato férrico, que são utilizados pela bactéria, formando H2S, que vai precipitar no 
meio, promovendo a coloração preta), o meio fica rosado (componentes nitogenados alcalinizam o meio), 
se observados retira-se da placa e leva para a próxima etapa 
→ Os meios de cultura utilizados também permitem o crescimento dos coliformes, por isso, o diferencial da 
fermentação da lactose. O coliforme fermenta a lactose, conferindo uma UFC e coloração características 
por acidificar o meio, enquanto a Salmonella não fermenta a lactose, logo, o meio fica mais alcalino, com 
UFC com outra característica e outra coloração relacionada ao indicador de pH (não ficam amarelados) 
 
★ Provas bioquímicas: 
Triagem: são feitas duas provas, TSI e LIA que são meios semissólidos estando em tubos de ensaio 
inclinados. Com alça de platina, estria-se em rampa ou bizel 
● LIA: como há descarboxilação da lisina, o pH do meio fica alcalino e continua em coloração roxa. 
Se ficar todo amarelo não é Salmonella (é coliforme), porque ela é lactose negativa 
● TSI: três açúcares e ferro, deve-se ver se houve fermentação da lactose (meio fica amarelo/ 
alaranjado). Se houver, pode descartar. Um outro açúcar presente em menor quantidade é a glicose, 
então, a bactéria começa fermentando ela, por isso o fundo do tubo fica amarelado. Como não 
fermenta a lactose, vai partir para quebrar a parte de nitrogênio (peptonas), o pH do meio fica 
alcalino, com coloração vermelho cereja, pode ter um precipitado preto por causa do H2S 
Obs: A incubação é feita a 35-37°C por 18h. Quando um microrganismo atua, a 1ª estrutura que ele quebra 
é o carboidrato, quando esse acaba (substrato), ele parte para as aminas (peptonas), fonte de nitrogênio 
 
Bioquímica: diante do resultado obtido, parte-se para as duas provas principais que são urease e 
fenilalanina desaminase (PHE), visto que o diagnóstico ainda pode ser confundido com o gênero Proteus 
(urease e fenilalanina desaminase positiva) e a A Salmonella será urease e fenilalanida desaminase 
negativa. Outras provas: SIM, VM/VP, Citrato (95%+), Arginina, ornitina e lisina (+), KCN (-), Malonato (-) 
 
Sorologia 
→ Ao confirmar Salmonella, será feita a avaliação da sorotipagem por soroaglutinação. Para tal, pega-se 
os soros, a cepa para observar se aglutina com determinado soro. A aglutinação depende do antígeno que 
a bactéria vai ter. Se ele tiver o antígeno somático (O), aglutina um soro, se tiver o antígeno flagelar (H) 
aglutina outro. Estuda a sorotipagem de acordo com o que foi visto na taxonomia 
→ Prova de antígeno-anticorpo, na qual são testadas as Ágar nutriente - suspensão bacteriana - soro 
polivalente (O e H) - aglutinação (positivo = aglutinação; negativo= sem aglutinação) Obs: Também 
identificado por PCR 
 
Controle 
→ Adoção de programas de autocontrole (PPHO, APPCC) e de boas práticas de fabricação (BPF), evitar 
contaminação cruzada, fazer treinamento de manipuladores quanto à higienização e saúde (carteira de 
saúde, exames rotineiros), evitar a presença de animais de estimação, não ingerir ovo e leite crus 
→ Exclusão competitiva: uso de probióticos/simbióticos na ração. Os probióticos são capazes de se ligar 
aos sítios da mucosa intestinal, retirando o sítio disponível para o patógeno se ligar. Esse controle está mais 
associado à prevenção da disseminação do microrganismo nos plantéis 
→ Tratamento de efluentes, higiene no abate, pasteurização do leite, conservação e cocção a temperaturas 
ideais, água com qualidade, evitar presença de insetos/animais 
 
 
Isolamento de Listeria monocytogeneses 
Introdução 
→ Família listeriaceae, Listeria monocytogenes é a espécie de importância, por ser um microrganismo 
emergente, isolada em alimentos de origem animal e envolvida em surtos atuais 
→ Crescimento intracelular: mais difícil tratamento, sendo invasivo, apresentando sintomas e 
patogenicidade mais críticos (principalmente para os grupos de risco). Os grupos de risco são 
imunodeprimidos, idosos, crianças e gestantes 
→ Padrão na atual legislação: antigo era ausência, hoje é até 100 UFCs em determinados alimentos, porém 
os alimentos destinados para grupo de risco ainda é ausência 
→ A pasteurização do leite é o suficiente para eliminação da bactéria 
 
Características 
→ Características morfotintoriais: bastonetes gram + flagelados 
→ Características fisiológicas são muito sensíveis a temperaturas elevadas. Podem crescer de temperatura 
baixas até 49, podendo se desenvolver em temperatura de geladeira e durante o congelamento 
sobrevivem, sendo psicotroficos. Se for feito o tratamento térmico adequado ele se invibializa. Tolera sal até 
10%. Em relação ao pH, precisa estar acima de 4,4 e até 9, o seu pH ótimo é em torno de 7. É um dos 
poucos microrganismos patogênicos que conseguem sobreviver em atividade de água em torno de 0,92. 
→ Características epidemiológicas: 
● Histórico: a importância do estudo desse microrganismo é causar enfermidades vinculadas a 
alimentos que podem ser autolimitantes (geralmente) ou levar a quadros graves em 
imunocomprometidos e causar óbito. Na década de 70, a microbiologia de alimentos se 
desenvolveu muito por conta das novas biotecnologias (genética, microscopia). Na década de 80, a 
listeriose causou transtorno severos a muitas populações e isso junto os avanços da década de 70 
levaram a maioresestudos e informações sobre esse microrganismos 
● Está presente nos mais diferentes ambientes e animais (até inseto, peixes e anfíbios tem), tem 
distribuição cosmopolita. A contaminação se dá através de alimentos contaminados, como laticínios, 
produtos cárneos e vegetais. Nos animais habitam o trato gastrointestinal 
● Pode causar duas síndromes (se apresentam de duas formas nos hospedeiros): 
○ Gastrointestinal: ocorre pela colonização do TGI pela bactéria, possui período de incubação 
de 8 a 16h e após a pessoa tem enjoo, mal estar, vômitos e diarreia. Transmissão se dá pelo 
consumo de alimentos que não foram tratados termicamente ou que são consumidos crus 
○ Forma invasiva: é rara e muito grave, que ocorre quando a bactéria ultrapasse a barreira 
intestinal e realize bacteremia, atingindo diferentes órgãos (e assim, se transforma na forma 
invasiva). Pessoas saudáveis dificilmente desenvolvem a forma invasiva 
● Sinais clínicos: depende do órgão acometido que o MO vai se instalar e estado de saúde da pessoa 
○ Em mulheres grávidas pode provocar aborto, feto natimorto ou nascimento pré maturo 
(nesse caso o feto pode ter lesões serias). Sendo portanto, uma infecção bastante 
preocupante, quando não leva ao óbito pode ter lesões sérias no recém-nascido. 
○ Em idosos ou imunocomprometidos pode causar meningite 
● Prevenção: considerando as consequências da listeriose, percebemos a importância da prevenção, 
que se da por meio de alimentos seguros, tratados termicamente (embutidos, produtos lácteos, 
cárneos). A presença desse microrganismos não altera nem odor e nem sabor do alimento ⚠O 
tratamento é com base em antibioticoterapia 
 
 
Padrão microbiológico 
→ Alimentos pronto para consumo (APC): n=5; c=1, m=102 
→ Alimentos para lactantes vão ter n=10, c=0, m = ausente 
→ Meios de cultura básicos: devem ter a capacidade de recuperar concentrações baixas de microrganismos 
como 100 unidades por grama ou ml de alimento. Os meios analíticos devem ser finos e sensíveis para 
recuperar esses microrganismos injuriados (sofre dano fisiológico, mas não morre, logo está viva e não 
cultivável) ou em baixas concentrações. Tem uma etapa de cultivo em meio líquido não seletivo para 
enriquecimento e depois, os meios que cresceram (apresentaram turbidez), passam para cultivo em placa 
em meios muito seletivos, após isolada a colônia vai para análises nas provas bioquímicas. ⚠Também é 
possível isolar a partir de amostras de sangue do paciente em casos de bacteriemia 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Isolamento de Clostridium perfringens 
Introdução 
→ Pode desencadear três processos nocivos aos seres humanos: infecção alimentar, enterite necrótica e 
gangrena gasosa 
→ Está entre os cinco microrganismos mais frequentes em intoxicações alimentares, veiculados por carnes 
bovinas e frango - principalmente em peças maiores, geralmente em ambientes festivos com volume maior 
de alimentos (que cria ambiente de anaerobiose, reduz a troca de O2 com ambiente e temperatura não foi 
suficiente para eliminar os esporos) 
 
Características 
→ Características morfotintoriais: bastonetes gram +, imóveis, capazes de produzir esporos, o que torna 
esse microrganismo muito resistente a temperatura elevada 
→ Características fisiológicas: temperatura de 43 a 45°C (termófila); anaeróbio; formador de esporos: 
posição do esporo no esporângio é terminal (diferente do B. cereus); germinação ocorre quando é 
submetida à choque/estresse térmico (aquecimento), passam de esporo para a forma vegetativa; pH ótimo 
de 6 a 7, faixa de crescimento de 5 a 9; reprodução rápida e criptobiótico (capaz de se reproduzir desde que 
as condições estejam favoráveis); 
 → Características ecológicas: ampla distribuição ambiental: a carga inicial no alimento deve ser a menor 
possível - é necessário higiene no processamento; capaz de sobreviver por muito tempo no solo 
→ Características gerais: são classificados de acordo com seus sorotipos, os quais são denominados de 
acordo com o tipo de enterotoxina que produzem = é um fator de agressão, pode produzir as toxinas A, B, 
C, D, E e F, sendo a A a mais preocupante (CPE), quanto a enterite necrótica o tipo C é o mais preocupante 
 
Patogênese 
→ Sorotipo A: a forma vegetativa é ingerida e chega ao intestino delgado, onde produz toxina em seu 
interior e, depois, rompe o esporângio, liberando-a (causa infecção). Essa toxina penetra e adere na 
membrana citoplasmática da célula da vilosidade intestinal, alterando sua permeabilidade seletiva 
formando poros, o que leva ao quadro de diarreias e desequilíbrio hidroeletrolítico, cólicas e dor 
abdominal. Seu período de incubação é de 8-16h após o consumo nado, é uma típica infecção alimentar e 
causa doença autolimitante (sintomas duram em torno de 24h) sem grandes repercussões 
 
Padrão microbiológico → n = 5; c = 1; m = 10²; M = 10³, costumam causar doença quando há > 10⁶ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Isolamento de Staphylococcus Coagulase positivo 
Introdução 
→ Ênfase dada ao grupo Staphylococcus Aureus, é um importante desencadeador de intoxicação 
alimentar, uma das mais frequentes causadoras de infecções alimentares no planeta como todo 
(classificada como categoria 3 = moderada agressão com evolução autolimitante, mas gera desconfortos 
significativos). A bacteremia pode gerar osteomielite, meningite, endocardite, conferindo um alto grau de 
mortalidade. Os grandes veiculadores são manipuladores de alimentos com feridas de pele ou portadores 
assintomáticos. Essas bactérias estão cada vez mais resistentes à microbianos e adaptadas 
→ Epidemiologia: os alimentos mais envolvidos são produtos lácteos (leite, creme de leite, manteiga) e 
cárneos (frango, presunto). Em processados, indicam problemas de higiene, manipulação, sanitização e 
temperaturas. Em crus, relacionados a animais doentes (mastite) e contaminações humanas (manipulação) 
 
Características 
→ Características morfotintoriais: cocos gram + (forma de cacho de uva), não formam esporos (em 
processos de pasteurização são sensíveis a altas temperaturas e podem ser inativadas, mas a sua 
enterotoxina não é), imóveis, anaeróbios facultativos, catalase + e oxidase - 
→ Características fisiológicas: temperatura de 35-37°C (mesofílicos); capaz de se desenvolver na 
presença de NaCl (sal) 5-10% (meio manitol salgado pode ser utilizado, mas cresce na ausência também); 
capaz de crescer com atividade de água baixa (diferente da maioria dos microrganismos - Aw 0,99-0,83); 
pH ótimo de 7-7,5, mas pode ir de 4,7 até 9,3; aeróbios ou anaeróbios facultativos (nunca será anaeróbio) 
ou até microaeróbios 
→ Características ecológicas: o reservatório importante é o ser humano (portador sintomático ou 
assintomático) pela manipulação de alimentos. Presente no trato respiratório superior (narinas) de 60% da 
população (em condições normais não causa doença); pode estar presente no solo e água 
 
Patogênese 
→ Intoxicação provocada pela ingestão do alimento contendo a enterotoxina pré formada // Período de 
incubação: de 30 min até no máximo 7h 
→ Sintomas: náusea, vômito, diarréia, dor abdominal,, raramente é fatal. O tratamento geralmente é 
sintomático, com foco na hidratação // Higiene: manuseio de alimentos com as mãos limpas e luvas 
 
Metodologia analítica 
→ Diluição e plaqueamento: transfere 0,1 mL de alíquota no centro e espalhar com bastão de hockey, 
fazendo semeadura por superfície (pour plate) no meio de cultura Agar Baird Parker (que possui 
características que impedem outros microorganismo de crescer) adicionado de emulsão de gema, que 
permite tanto o crescimento e como a visualização da atividade lipolítica e proteolítica (aparecimento de 
halo de transparência na proteólise e precipitação ao redor da colônia na lipólise) e de telureto de potássio 
(confere coloração negra da colônia). Então, ocorre a incubação a 37°C por 24h das placas invertidas 
→ Colônia característica enegrecida com halo esbranquiçado de precipitação e halo transparente 
→ Testeda coagulase: transfere 0,3 mL de cada tubo com BHI para tubos estéreis contendo 0,3 mL 
de plasma de coelho e ocorre a incubação de 35-37°C por 24, para verificar presença de coágulos 
● Reação -: sem coágulo / Reação +: formação de grumos, se desprendem caso o tubo seja invertido 
ANOTAR ESSA PARTE DE REACAO DO resumo 
Padrão microbiológico → n = 5; c = 1; m = 10²; M = 10³ 
 
 
Enumeração e Identificação de Bacillus cereus 
Introdução 
→ É um microrganismo com capacidade de formar biofilme, é proteolítico, tem 
capacidade de formar esporos, possuindo grande importância na indústria 
→ Taxonomia é dificultada pela elevada heterogeneidade nas característica genotípicas e 
fenotípicas, logo a nomenclatura Bacillus cereus corresponde a um grupo latu sensus 
→ Epidemiologia: o solo é seu reservatório natural, é uma causa conhecida de mastite, 
especialmente em ovelhas e novilhas. Causa infecções oculares, abscessos, meningite, 
septicemia e infecção de feridas 
 
Importância na indústria de alimentos 
→ Problema sério nas indústrias devido a sua capacidade de formar esporos termoresistentes, os quais 
são resistentes ao calor e podem se aderir fortemente a superfícies, incluindo aço inoxidável 
→ Formação de biofilme é extremamente resistente, em que se forma uma película contendo inúmeros 
microrganismos. Suas características de hidrofobicidade e presença de filamentos tornam sua remoção 
muito difícil. Isso é um ponto crítico na indústria de leite, na qual o problema são as tubulações, que são de 
difícil limpeza, podendo, assim, ter a formação de biofilmes. A água não dissolve o biofilme, por isso, 
deve-se ter um controle permanente, não se deve deixar chegar nessa situação. É preciso fazer uma 
pesquisa sistemática para saber se está tendo algum problema na matéria-prima 
→ Gera defeitos no leite UHT: de sabor, amargor do creme, coagulação e ação de lipases, fosfolipases e 
proteinases secretadas pelo B. cereus. É um MO proteolítico e o leite é composto de água e proteína 
→ Uma larga variedade de alimentos tem sido associada em surtos, tais como carnes, leite, peixes, arroz, 
batatas, massas, queijos, misturas com molhos, pudins, sopas, assados e saladas - não tem um específico 
→ Mediadas de controle: tratamento térmico adequado, manutenção da temperatura acima de 65ºC depois 
do alimento pronto, resfriamento rápido para armazenar 
 
Características 
→ Características morfotintoriais: bastonetes gram + delgados e em cadeia; formadores de esporos 
(centrais ou subterminais), característica extremamente importante pois sobrevivem a pasteurização 
(termoduricos); aeróbios (difernete de Clostridium que é anaerobio) 
→ Características fisiológicas: temperatura de10 a 48°C (a ótima é de 30-35°C); pH amplo (4,9 - 9,3); 
flagelos peritríqueos (confere alta mobilidade e fixação), logo são móveis (90%) 
 
Patogenia 
→ Toxinfecção relacionada à ocorrência de uma síndrome emética é causada pela ingestão da toxina 
pré-formada, tendo período de incubação de 30min a 6h. E na síndrome diarreica ocorre a ingestão do 
microrganismo (toxina produzida no intestino delgado), tendo período de incubação de 8 a 24h 
→ A toxina responsável pela síndrome emética é a cereulida, que é termoestável (resiste a mais de 30 min 
a 121°C), é resistente à proteólise (insensibilidade à tripsina e à pepsina), estável em pH entre 2 e 11 e 
sintetizada entre 25 e 30°C. Os vômitos aparecem logo após a ingestão dos alimentos contaminados. Dada 
a sua resistência, a toxina emética não é destruída pelo cozimento ou por enzimas digestivas 
→ A toxina responsável pela síndrome diarreica é a toxina HBL, que é termorresistente, hemolítica, 
dermonecrótica e aumenta a permeabilidade dos capilares, provocando acúmulo de líquidos (em algumas 
situações pode chegar a ter desidratação) 
 
 
→ É preciso ter contagens entre 105 e 107 UFC/g (alta) para gerar sintomas da doença. A produção da 
toxina ocorre na fase logarítmica (Log) de crescimento e/ou esporulação 
 
Isolamento e identificação 
→ A contagem baseia-se na inoculação de diluições sob teste em ágar polimixina gema de ovo vermelho 
de fenol (MYP) ou em ágar cereus (PEMBA). A polimixina B é um agente seletivo utilizado nos dois meios, 
que atua sobre a flora acompanhante, ambos contêm manitol (B. cereus não fermenta manitol), ou seja, o 
vermelho de fenol não é ativado. A gema de ovo dá o fornecimento da lecitina, que é quebrada, formando 
um halo ao redor 
⚠ Enumerá-los é muito complicado, pois são móveis, mas geralmente há UFCs que podem ser contadas. 
Ele vai se desenvolvendo e se espalhando até formar uma massa, a identificação é simples e fácil. Um caso 
grave especialmente na indústria de laticínios 
→ Provas bioquímicas: observa formação de β-hemolisina, motilidade em meio semisólido, capacidade de 
decomposição da tirosina, redução do nitrato a nitrito, tipo de crescimento em superfície de ágar nutriente 
 
Inoculação 
 → Procedimento: inclui a pesagem e preparo da amostra, pesando de 25 ± 0,2g da amostra e adicionar 
225mL de solução salina peptonada 0,1%. Após, homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em 
“stomacher”. Essa é a diluição 10-1 na proporção de 1:10. Realiza-se semeadura por superfície 
→ Emulsão de gema: é adicionada para observar proteólise (halo de transparência) e lipólise (halo de 
precipitação, deixa o pH mais básico, deixando colônias azuladas no aga PEMBA e o MYP fica rosa s/a) 
→ Ágar PEMBA: bacilos produzem a lecitinase, que hidrolisa a lecitina, gerando colônias azuis com zonas 
de precipitado branco ao redor delas. Detecta pequena quantidade de B. cereus na presença de grande 
quantidade de contaminantes ⚠ Se hidrolisar e ficar azul é B. cereus, se ficar amarelo é S. aureus (FOTO) 
→ Ágar MYP: a partir da diluição inicial 10-1 deve-se efetuar as diluições desejadas. Inocular sobre a 
superfície seca do ágar MYP 0,1mL de cada diluição selecionada. Com auxílio de alça de Drigalski ou bastão 
tipo “hockey”, espalhar o inóculo cuidadosamente por toda a superfície do meio até completa absorção 
(semeadura em superfície). Geram colônias rosas e lecitinase positivas. Visualiza na placa UFC espalhada 
(móvel) e forma um halo claro (opaco) de lipólise e outro mais claro (transparente) ao redor (proteólise) 
→ Incubam-se as placas invertidas a 30 ± 1°C por 30 a 48 horas. Para leitura, selecionam-se placas que 
contenham entre 15 e 150 colônias. Deve-se contar as colônias rodeadas por um halo de precipitação 
opaco sobre um fundo róseo, no ágar MYP. Depois, seleciona-se de 3 a 5 colônias típicas que serão 
semeadas em tubos com ágar nutriente inclinado (que irá permitir a realização de provas bioquímica e 
classificação de B. cereus presuntivas dependendo dos resultados), sendo incubadas 36 ± 1°C por 24 
horas. Das colônias selecionadas no tubo, fazer esfregaço e corar pela técnica de Gram para verificar a 
presença de bastonetes curtos Gram positivos, com extremidades quadradas dispostos em cadeias. O 
resultado se dá a partir do cálculo do número de B. cereus multiplicando o número de colônias confirmadas, 
nas provas confirmativas, pelo fator de diluição usado (expressar o resultado em UFC/g ou mL) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Identificação bioquímica 
→ Hidrólise da gelatina (+): é extremamente simples, o objetivo é saber se a suspeita de B. cereus produz 
ou não a gelatinase (hidrolisa a gelatina em aminoácidos). Se a degradação ocorre, não se consegue 
restaurar as características de gel da gelatina, mesmo a baixas temperaturas, ficando líquido. Inocula-se por 
picada (agulha) um meio de cultura gelatina e incuba-se a 37°C durante 24 a 48h. Nesse processo, a 
gelatina ficará líquida. Depois, as culturas são colocadas em geladeira a 4°C durante 30min. Se o 
microrganismo produzir gelatinase, quando a cultura for colocada na geladeira e não solidificar, o resultado 
será gelatinase positiva. Ou seja, a reação é positiva quando a gelatina é hidrolisada pela gelatinase, 
assim, o meio se mantém líquido após refrigeração. Se o microrganismo nãopossui gelatinase, o meio 
resolidifica durante o período em que está na geladeira, ou seja, a reação é negativa 
→ Motilidade e redução de nitrato: inocular com agulha tubos contendo ágar motilidade-nitrato e 
incubar a 36 ± 1°C por 18 a 24 horas. Após, observar o tipo de crescimento presente. Se crescer 
apenas ao longo da picada (crescimento apenas na linha de inoculação), o microrganismo não é 
móvel, se crescer de forma difusa o microrganismo é móvel. Após a leitura da motilidade, deve-se 
adicionar aos tubos 2 a 3 gotas de alfa naftilamina 0,5% e 2 a 3 gotas de ácido sulfanílico 0,8%. O 
aparecimento de coloração rosa indica positividade para redução de nitrato (B. cereus reduz o 
nitrato a nitrito) ⚠Sugere-se fazer a picada e estrias na superfície para observar logo a reação do 
alfa naftilamina e do ácido sulfanílico na superfície 
→ β-hemólise em ágar sangue de carneiro: não é muito realizada no laboratório, mas, nessa técnica, 
inocula-se por estria em placa com ágar sangue de carneiro. Incubar a 36 ± 1°C por 24 horas e, após, 
observar a produção de β-hemólise (característica do B. cereus) 
→ Decomposição da tirosina: inocular por estrias a superfícies de ágar tirosina (inclinado em tubo ou 
distribuído em placas), incubar a 36 ± 1°C por 48 horas. Após incubação, observar o aparecimento de 
uma zona clara próxima ao crescimento produzida pela decomposição da tirosina. Nos casos em que 
houver dúvidas, reincubar por até 7 dias a 36 ± 1°C. Observa-se o resultado de 2 formas: o meio de cultura 
mudando de cor ou formação de halo ao redor indica decomposição da tirosina (positivo) ⚠ Prof não gosta 
→ Crescimento rizóide: inocular com alça sobre a superfície de ágar nutriente, depositando o inóculo no 
ponto central da placa. Incubar a 36 ± 1°C por 48 a 72 horas e verificar o tipo de crescimento. Crescimento 
rizoide é o aparecimento de colônias com longas extensões em forma de raízes/longos fios, típicas de 
Bacillus mycoides. O B. cereus não apresenta crescimento rizoide, porém, algumas cepas podem 
apresentar colônias rugosas em forma de galáxia (negativo para crescimento rizóide) 
 
Provas diferenciais para microrganismos do gênero Bacillus 
→ O grande problema que se tem na legislação com relação ao B. cereus 
é que após todas essas provas há apenas B. cereus presuntivo, pois todos 
esses resultados também são idênticos para B. thuringiensis. Apenas uma 
lâmina corada pela técnica da fucsina básica pode distingui-los, na qual 
observa-se corpúsculos no B. thuringiensis (tem reserva estrutural e 
energética = corpúsculos de inclusão cristalina) 
→ Teste para verificação da presença de corpúsculos de inclusão cristalina: a partir de culturas suspeitas 
repicadas em ágar estoque inclinado e deixadas em temperatura ambiente por 2 a 3 dias, verificar a 
presença de corpúsculos de inclusão cristalina (frequentemente usados como materiais de reserva 
energética ou reserva de materiais estruturais), B. cereus não produz corpúsculos de inclusão cristalina. A 
legislação antiga (2001) já afirmava que era B. cereus após resultado dos testes bioquímicos, mesmo sem 
fazer a técnica de coloração com fucsina básica. Em 2019 mudou, pois afirma que após essas provas o 
resultado é de B. cereus presuntivo, mas também não se pede para fazer a lâmina e diferenciar