Copia de P2 Controle Microbiologico

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Isolamento e Identificação de Salmonella 
Introdução 
→ Salmonella spp. é um dos microrganismos mais envolvidos em surtos de origem alimentar ( junto à E. 
coli e Staphylococcus), pois têm cepas muito patogênicas. Apesar de não ser formadora de esporos (cél. 
de resistência bacteriana), ela tem capacidade de formar uma célula viável e não cultivável (CNV), capaz 
de se manter viável em ambientes que não são favoráveis - microorganismo fastidioso de difícil isolamento 
→ Microbiota autóctone é a acompanhante do alimento (que geralmente está numa concentração maior), 
já a Salmonella faz parte da microbiota contaminante, por isso costuma ser o microrganismo em menor 
quantidade, o que dificulta seu isolamento. Nas etapas de isolamento da Salmonella são feitos processos 
com o intuito de inibir o cresc da microbiota interferente/acompanhante para que a Salmonella possa 
crescer Questão de prova: se manter viável e não cultivável e ter microbiota autóctone 
→ Habitat: trato gastro-intestinal de homens e animais. Os reservatórios de Salmonella são as aves (é o 
principal reservatório, presente em carne e ovos), homens, suínos, répteis, mamíferos domésticos e 
silvestres. O homem inclusive pode se tornar um portador assintomático (elimina mas não desenvolve a 
doença, virando uma fonte de contaminação dentro da cadeia produtiva) Questão de prova 
→ A contaminação pode ser pelos poros da casca no momento da postura e na própria formação do ovo, 
ou do próprio trato intestinal no momento da evisceração - dentro da indústria pode causar danos para o 
consumidor final, por isso, é importante que a indústria tenha boas práticas de manipulação. Esse gênero 
está muito associado à questão da contaminação cruzada dentro da indústria ligada à falta de boas 
práticas ou na área de esfola, quando se tem o rompimento do TGI, contaminando a carcaça e o ambiente, 
logo, se não for feita limpeza adequada do ambiente e da faca utilizada, pode carrear o microrganismo. Um 
agravante é o fato de se ter portador assintomático, podendo estar na microbiota sem causar alterações no 
hospedeiro, facilitando a contaminação de alimentos 
Obs: Muito pessoas lavam o frango, espalhando Salmonella (se estiver presente) ou ao usarem a mesma 
faca que cortou o frango cru para cortar um frango pronto, legumes ou verduras. Outro problema é o uso de 
tábua de madeira ou colher de pau, que têm material poroso 
 
Características 
→ Família Enterobacteriaceae, bastonetes Gram negativos, não esporulados, oxidase negativa (não 
sintetizam a enzima oxidase, que faz com que o oxigênio seja usado como último receptor da cadeia de 
elétrons no metabolismo do microrganismo), a maioria são móveis (flagelos peritríquios ao longo da 
célula, exceto S. Gallinarum e S. Pullorum, que são consideradas imóveis - motilidade se torna um fator 
de virulência), anaeróbios facultativos 
→ Mesófilos: crescem em temperaturas de 7-49,5°C, e temperatura ótima de 35 a 37°C. São sensíveis a 
baixas temperaturas (é preciso colocar o Vi entre parênteses, indicando que a 
expressão antigênica pode estar constante ou não, mas a célula é capaz de produzir. Ou seja, se o sorotipo 
tiver (Vi), significa que ele é capaz de formar a cápsula, mas pode ou não expressar (geralmente, a célula vai 
expressar esse antígeno quando está em um momento de desconforto bacteriano) 
 
★ Antígenos Flagelares (H): 
→ Os antígenos flagelares conferem motilidade à célula bacteriana, a principal proteína é a flagelina 
(molécula que será sintetizada para dar origem ao flagelo), em que em sua formação sofre muitas 
alterações em termos de sequência de aminoácidos (mudança da ordem dos aminoácidos). Serão 
chamados de monofásicos quando são capazes de formar 1 flagelo (apresenta apenas uma fase) e 
bifásico quando são capazes de formar esse flagelo em fases diferentes (maioria das cepas tem variação 
de fases). São termolábeis (destruidos por calor) 
→ Por existirem diversos tipos, o H é suprimido da fórmula, sendo representados por letras minúsculas e 
números. São identificados tanto por letra como número de acordo com a sequência de aminoácidos, pois 
existem microrganismos que vão ser capazes de formar flagelos em situações diferentes 
● Fase 1: expresso por letras minúsculas (fase específico) - quando é monofásico 
● Fase 2: expresso por números (fase grupo) - quando é bifásico (maioria das cepas de Salmonella) 
 
Obs: Parênteses indicam a constância da expressão do gen e não qual é maior (principal) ou menor 
(secundário). Quando não há formação de cápsula nada é indicado (lembrar que se Vi estiver fora de 
parênteses indica que a formação é constante). A separação dos antígenos ocorre pelas vírgulas e tudo que 
for após os dois pontos será correspondente aos antígenos flagelares Questão de prova: 
 
Provas bioquímicas 
→ Oxidase e Lactose negativas, não produzem butilenoglicol (VP negativo), VM positivas, reduzem nitrato 
a nitrato. As principais provas para Salmonella: Fenilalanina desaminase negativas e Urease negativas - 
estudam a capacidade do MO em degradar a ureia e a fenilalanina, e a Salmonella não sintetiza a enzimas 
fenilalanina desaminase e urease, ambas as provas são negativas = durante a análise, é muito comum a 
Salmonella dar diagnóstico cruzado com o gênero Proteus, logo essas provas sã importantes pois permite 
a diferenciação (é positivo nas duas provas) Questão de prova: diferenciar Salmonella e Proteus 
Obs: O mais importante para se saber da bioquímica é que é Lac - e as principais provas (fenilalanina 
desaminase e urease) Questão de prova: 
 
 
Epidemiologia 
→ Locais de detecção: fezes, água, alimentos (habitat é o TI homem e animais), alimentos processados 
→ Salmoneloses de animais para humanos: Salmonella Enteritidis e S. Typhimurium (pandêmicos) 
→ Salmoneloses de humanos: S. Thyphi e S. Parathyphi (febres) - imunodeprimidos são grupo de risco 
→ Sorovares adaptados/restritos ao hospedeiro: S. Gallinarum (aves), S. Dublin (gado), S. Cholaraesuis 
(suíno), S. Abortusequi (equino), S. Abortusovis (ovinos) 
→ Aves migratórias podem ser portadoras assintomáticas, sendo grandes dispersores do microrganismo 
no ambiente através das fezes, gerando contaminação Busavalario 
→ Portador assintomático: >5% são portadores assintomáticos, que são um grande problema na indústria 
→ Doença dos 4 F's: finger (dedos - manipulador), food (alimento, principalmente dos principais tipos 
pandêmicos), fly (mosca) e faeces (fezes). Justamente por essa quantidade de reservatórios, a doença pode 
vir pelo homem, pela água, transportada por animais (questão da higiene) 
 
Transmissão 
→ Pode ocorrer de forma direta, por fontes residuais de água e esgoto e por alimentos processados 
→ Enfermidade de morbidade alta, mas a mortalidade é baixa (exceto para grupo de risco 
imunocomprometidos - doença muito associado à morte em pessoas com AIDS, principalmente pela baixa 
imunidade. Porém, no geral, a doença é autolimitante, causando problemas de gastroenterite forte 
→ Algumas cepas possuem multirresistência antimicrobiana e causam impacto socioeconômico muito 
grande, por estarem envolvidas em surtos de origem alimentar e, apesar de ser uma doença com curso 
autolimitante, pelos gastos hospitalares e com afastamento de funcionários 
→ A enfermidade pode ser classificada como sendo do tipo septicêmica, entérica ou assintomática: 
● Septicêmica: bactéria cai na circulação sanguínea e causa sintomas mais graves, podendo levar até 
à sepse. As principais são a S. Typhi e Paratyphi (febre tifoide e paratifoide). São sorotipos mais 
veiculados pela água, transmitidos de homem para homem, não de animal para o ser humano 
● Entérica: responsável pela Salmonelose, que causa uma gastroenterite, levando a diarreia, vômito 
e dores abdominais. As principais são a S. Typhimurium e S. Enteritidis 
● Assintomática: gera problemas na indústria, já que o homem pode veicular o microrganismo sem 
desenvolver a doença, sendo um ponto de contaminação da indústria 
→ A Salmonella pode causar infecção alimentar ou toxinfecção alimentar. Muitas cepas são capazes de 
produzir toxinas (enterotoxinas e citotoxinas), sendo sintetizadas já no trato intestinal, por isso chamamos 
de toxinfecção alimentar Quando a toxina é pré-formada no alimento (como botulismo), a intoxicação é 
por alimentação, em que a ingestão da toxina pré-formada vai ocasionar a patologia. Quando a toxina é 
formada pelo microrganismo no TGI - pela célula viável que foi ingerida- o processo é chamado de 
toxinfecção 
→ Febre tifóide (S. Typhi): doença de natureza entérica e sistêmica, caindo na corrente circulatória e indo 
para outros órgãos, sendo os principais fígado e baço, as bactérias se multiplicam dentro das células 
fagocitárias. Pode evoluir para infecção generalizada, gerando septicemia, artrite séptica. Sintomas: febre 
alta contínua, dores abdominais e de cabeça, letargia, vômitos, diarreia ou constipação, perda de apetite, 
erupção cutânea 
→ Enterocolites (Salmoneloses): doença causada pelos sorotipos pandêmicos, acomete a luz intestinal 
(mucosa intestino delgado e cólon), tendo adesão e penetração no epitélio intestinal (lâmina própria). Se 
multiplicam e ocorre a internalização, ocasionando “arrepio” (ruffing) devido ao engolfamento de 
pseudópodes e à reação inflamatória causada por eles, produzindo enterotoxina e endotoxina (LPS). 
Geralmente é autolimitante (exceto grupo de risco), mas os sintomas incluem cólicas abdominais, náuseas, 
vômitos, diarreia, calafrio, cefaleia e febre (caso seja crônica pode ocasionar artrite também) 
 
 
Isolamento 
→ Para a maioria dos alimentos o padrão para Salmonella é ausência em 25g. Exceto para aves, em que, 
uma vez identificado em carcaças, deve-se partir para a pesquisa de sorotipos pandêmicos que são 
Typhimurium e Enteritidis, que devem estar ausentes 
→ A Salmonella é um microrganismo difícil de ser isolado por ser fastidioso, sendo difícil a recuperação 
da célula bacteriana fazendo com que ela expresse as características em meio de cultura, principalmente 
por estar em menor quantidade. Por causa disso, o isolamento é dividido em fases: 
Pré-enriquecimento Enriquecimento seletivo Plaqueamento seletivo Triagem Bioquímica 
 
★ Pré-enriquecimento: 
→ É a fase nutritiva, em que se entra com uma solução com objetivo de recuperar a célula bacteriana 
(injuriada, que sofreu lesão), utilizando um caldo nutritivo não seletivo = Água Peptonada Tamponada 
(APT - confere pH ideal), Caldo Lactosado, Caldo Manitol, Caldo Sorbitol, Caldo Triptonado, Caldo 
Peptonado. Não tem nenhum componente seletivo porque não se pode estressar a célula bacteriana (mais 
do que ela já está estressada). O alimento vem anteriormente de um processamento tecnológico, que já 
ocasiona lesões e injúrias na célula bacteriana, então, é preciso recuperar a bactéria dessa injúria, pois, se 
não, ela não se expressa no meio de cultura. Após 24h, amostra vai para a etapa de enriquecimento 
→ Pega-se a amostra em que se está pesquisandoSalmonella, pesa 25g e depois coloca em 225mL de 
APT. A incubação é feita a 35-37°C (microrganismo mesófilo) por 18-24h. Se for positivo, espera-se que 
ela cresça, se desenvolva e se recupere das lesões e injurias sofridas, principalmente de membrana celular 
Obs: Como a bactéria está presente no alimento está em menor quantidade, não se faz diluições seriadas 
 
★ Enriquecimento seletivo: 
→ É a fase em que se entra com caldo nutritivo seletivo nos meios de cultura (Caldo Mossel, Rapapport 
Vassiliadis, Selenito-Cistina, Selenito e Tetrationato - não pergunta nome de meio na prova, mas tem que 
saber a importancia de cada etapa), que possui compostos que vão inibir a microbiota acompanhante 
(gram + principalmente) e favorecer o crescimento da Salmonella (seletividade). Trabalha-se sempre com 
dois meios de cultura diferentes para ampliar a chance de isolamento da Salmonella, para ver qual meio 
vai favorecer melhor o crescimento por ser fastidiosa 
→ Pega-se o caldo com 25g em 225mL de APT da fase anterior e começa a fase de enriquecimento 
seletivo. A incubação é feita a 35-37°C por 24h. Nessa segunda fase, opta-se sempre por trabalhar com 
dois caldos, saindo do pré-enriquecimento e semeando em dois tubos com caldos diferentes 
Obs: São dois meios de cultura diferentes porque é um microrganismo difícil de isolar e fastidioso, logo, o 
próprio componente antagônico de um caldo pode inibir a cepa de Salmonella. Por isso se trabalha com 
dois caldos, como Mossel e Rapapport Vassiliadis, para observar onde ela irá se adaptar melhor 
 
★ Plaqueamento seletivo: 
→ Observa-se se há suspeita de salmonella ou não, é a fase em que se trabalha com 2 ou 3 meios de 
cultura, dependendo da metodologia usada, dando mais chances para a Salmonella crescer. Os meios de 
cultura podem ser alta, média ou baixa seletividade: Alta: AVB; Bismuto Sulfito; XLD; Rambach; BPLS; Ágar 
XLT-4 (xilose-lisina-tergitol-4) // Média: Ágar S.S; Ágar Hektoen // Baixa: Ágar Mac Conkey; Ágar EMB 
Obs: Geralmente, pega-se um meio com alta, um com média e outro com baixa seletividade para criar 
condiceos mais favoreis para a multiplicação da bactéria e inibir a microbiota contaminante 
→ Semeadura por estria e esgotamento: pega-se os caldos e passa o microrganismo com auxílio de alça 
de platina para o meio de cultura, estriando nos quadrantes, com objetivo ter uma UFC isolada pura para 
estudar a bioquímica e chegar ao gênero e espécie. A incubação é feita a 35-37°C por 48h 
 
 
→ UFC típica de Salmonella: fica transparente e com o centro preto, pois produzem H2S (meios de cultura 
vão ter sulfato ferroso e citrato férrico, que são utilizados pela bactéria, formando H2S, que vai precipitar no 
meio, promovendo a coloração preta), o meio fica rosado (componentes nitogenados alcalinizam o meio), 
se observados retira-se da placa e leva para a próxima etapa 
→ Os meios de cultura utilizados também permitem o crescimento dos coliformes, por isso, o diferencial da 
fermentação da lactose. O coliforme fermenta a lactose, conferindo uma UFC e coloração características 
por acidificar o meio, enquanto a Salmonella não fermenta a lactose, logo, o meio fica mais alcalino, com 
UFC com outra característica e outra coloração relacionada ao indicador de pH (não ficam amarelados) 
 
★ Provas bioquímicas: 
Triagem: são feitas duas provas, TSI e LIA que são meios semissólidos estando em tubos de ensaio 
inclinados. Com alça de platina, estria-se em rampa ou bizel 
● LIA: como há descarboxilação da lisina, o pH do meio fica alcalino e continua em coloração roxa. 
Se ficar todo amarelo não é Salmonella (é coliforme), porque ela é lactose negativa 
● TSI: três açúcares e ferro, deve-se ver se houve fermentação da lactose (meio fica amarelo/ 
alaranjado). Se houver, pode descartar. Um outro açúcar presente em menor quantidade é a glicose, 
então, a bactéria começa fermentando ela, por isso o fundo do tubo fica amarelado. Como não 
fermenta a lactose, vai partir para quebrar a parte de nitrogênio (peptonas), o pH do meio fica 
alcalino, com coloração vermelho cereja, pode ter um precipitado preto por causa do H2S 
Obs: A incubação é feita a 35-37°C por 18h. Quando um microrganismo atua, a 1ª estrutura que ele quebra 
é o carboidrato, quando esse acaba (substrato), ele parte para as aminas (peptonas), fonte de nitrogênio 
 
Bioquímica: diante do resultado obtido, parte-se para as duas provas principais que são urease e 
fenilalanina desaminase (PHE), visto que o diagnóstico ainda pode ser confundido com o gênero Proteus 
(urease e fenilalanina desaminase positiva) e a A Salmonella será urease e fenilalanida desaminase 
negativa. Outras provas: SIM, VM/VP, Citrato (95%+), Arginina, ornitina e lisina (+), KCN (-), Malonato (-) 
 
Sorologia 
→ Ao confirmar Salmonella, será feita a avaliação da sorotipagem por soroaglutinação. Para tal, pega-se 
os soros, a cepa para observar se aglutina com determinado soro. A aglutinação depende do antígeno que 
a bactéria vai ter. Se ele tiver o antígeno somático (O), aglutina um soro, se tiver o antígeno flagelar (H) 
aglutina outro. Estuda a sorotipagem de acordo com o que foi visto na taxonomia 
→ Prova de antígeno-anticorpo, na qual são testadas as Ágar nutriente - suspensão bacteriana - soro 
polivalente (O e H) - aglutinação (positivo = aglutinação; negativo= sem aglutinação) Obs: Também 
identificado por PCR 
 
Controle 
→ Adoção de programas de autocontrole (PPHO, APPCC) e de boas práticas de fabricação (BPF), evitar 
contaminação cruzada, fazer treinamento de manipuladores quanto à higienização e saúde (carteira de 
saúde, exames rotineiros), evitar a presença de animais de estimação, não ingerir ovo e leite crus 
→ Exclusão competitiva: uso de probióticos/simbióticos na ração. Os probióticos são capazes de se ligar 
aos sítios da mucosa intestinal, retirando o sítio disponível para o patógeno se ligar. Esse controle está mais 
associado à prevenção da disseminação do microrganismo nos plantéis 
→ Tratamento de efluentes, higiene no abate, pasteurização do leite, conservação e cocção a temperaturas 
ideais, água com qualidade, evitar presença de insetos/animais