AULA 5 PCR

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

*
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase Chain Reaction
Reação em Cadeia da Polimerase
(Kary Mullis, 1993)
*
Tópicos
 PCR			
Alvos		 
Denaturação		
Primers		
Anelamento		
Ciclos		 
Requerimentos	 
*
DNA
Exemplo de padrão de ligação.
Padrão primário
	CCGAATGGGATGC
	GGCTTACCCTACG
Padrão complementar
	
*
DNA Molecule
Adenina
Timina
Guanina
Citosina
*
PCR = Polymerase Chain Reaction
ou
Reação em cadeia da Polimerase
ou
Reação de polimerização em cadeia
ou
Polimerização em cadeia do DNA
• Técnica de biologia molecular empregada para obter-se amplificação exponencial de pequenas quantidades de DNA in vitro, empregando elementos do processo natural de replicação do DNA.
• O conceito de amplificação do DNA não é novo e sempre foi utilizado, entretanto, a amplificação era feita in vivo e não in vitro como na PCR.
*
PCR
PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é uma técnica que amplifica uma sequência específica de DNA, como objetivo de torná-la abundante e disponível para diversas técnicas de biologia molecular.
*
PCR
• Fazer in vitro o que ocorre in vivo
– DNA polimerase termoestável (Taq)
– Termociclador
*
OS Alvos do PCR
Os alvos a serem considerados no PCR são as regiões que flanqueiam a sequência específica de DNA a ser amplificada, a qual pode ser um gene inteiro ou somente uma região pequena.
*
PCR Targets
O número de bases nos alvos pode variar.
TTAAGGCTCGA . . . . AATTGGTTAA
O . . . . Representa o meio da sequência de DNA, e não há problemas em não conhecê-la para poder amplificá-la.
*
PCR - Desnaturação
A desnaturação é o primeiro passo do PCR, no qual as fitas de DNA são separadas através de aquecimento a 95°C. 
*
PCR Primers
Os primers são sequências de 15 a 30 nucleotídeos, fita única, que são usadas para flanquearem as extremidades da região a ser amplificada. Marcam o início e o fim da sequência-alvo.
*
PCR Primers 
Um primer para cada extremidade da sua sequência alvo deve ser desenhado, para que as fitas sejam copiadas simultaneamente em ambas as direções.
*
PCR Primers
TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT
AATTGCCGGAATT . . . . . . . . . .>
e
 <. . . . . . . . . . AAATTTGGCCAA
TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT
*
PCR Primers
OS primers são colocados em excesso na reação de PCR, para que eles se liguem ao DNA alvo, ao invés das duas fitas se ligarem de novo uma a outra.
*
PCR - Anelamento
O anelamento é o processo através do qual duas sequencias de nucleotídeos são ligadas através da formação de pontes de hidrogênio. Na reação de PCR, o anelamento se dá através da ligação dos primers com o DNA Alvo, a temperatura de 55°C.
*
PCR Taq DNA Polimerase
O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a qual é uma bactéria encontrada sobrevivendo a altas temperaturas em geisers no Yellow Stone National Park.
*
PCR Taq DNA Polimerase
Essa bactéria produz uma enzima DNA polimerase, a qual amplifica o DNA a partir do anelamento com os primers, na presença de Mg, a altas temperaturas.
*
PCR Ciclos
*
PCR Ciclos
*
PCR Ciclos
*
PCR Ciclos
*
PCR Cycles
*
PCR Ciclos
Desnaturação: 94°- 95°C
Anelamento: 55°- 65°C
Extensão: 72°
Número de ciclos: 25-40
*
• Desnaturação do DNA molde (template) por aquecimento
• Pareamento dos primers à seqüência alvo fita simples
• Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase termoestável
*
PCR Ciclos
*
Primeiro ciclo da PCR
*
Após sucessivos ciclos
*
PCR Ciclos
*
PCR Ciclos
Número de cópias da 
Região alvo de DNA
A = 2n
n = número de ciclos
*
PCR Requerimentos
Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM
Tampão: pH 8.3-8.8
dNTPs: 20-200µM
Primers: 0.1-0.5µM
DNA Polimerase: 1-2.5 units
DNA Alvo:  1 µg
*
OTIMIZAÇÃO DA PCR – POR QUÊ?
Otimizar a amplificação para:
Aumentar a quantidade de produto final (eficiência)
Aumentar a especificidade, principalmente quando há grande background
Melhorar a reprodutibilidade (de tubo para tubo e de reação para reação)
Parâmetros a serem considerados na otimização:
Desenho dos primers
Condições de ciclagem
Concentração dos reagentes
Composição do tampão
*
DESENHO DOS PRIMERS
Tamanho ideal:
- O tamanho ideal de um primer depende de seu conteúdo de A+T e da Tm do primer oposto
- Deve ser complexo o suficiente para evitar o pareamento em regiões inespecíficas
Usualmente oligonucleotídeos de ~20 bases (a probablididade de uma sequência específica de 20 bases ocorrer em um genoma é uma vez a cada 420 bases)
*
Desenho dos primers
• O pareamento específico depende criticamente da temperatura, além de ser influenciado pela concentração de cátions, pelo tempo na temperatura de pareamento e outros fatores
• A temperatura de pareamento deve ser a mais alta possível
Cálculo da Tm (< 20 bases)
Tm = 4(G+C) + 2(A+T) oC Tanel = Tm – 4oC
MENOS
ESPECIFICIDADE
(bandas inespecíficas)
MAIS ESPECIFICIDADE
(menor rendimento)
TEMPERATURA DE
ANELAMENTO
*
Desenho dos primers
RECOMENDAÇÕES:
• Tamanho: 15 a 20 bases
• Sequência: 40-50% de G+C distribuídos aleatoriamente
• Checar para formação de estruturas secundárias internas
• Evitar complementariedade entre os pares de primers, principalmente na posição 3’ (primer-dimer ou dímeros de primers)*
• Checar se o par de primers tem Tanel próximas (no máximo, de 2 a 3ºC de diferença)
*
 Touch down PCR – melhora rendimento da PCR:
Exemplo: variar a temperatura de pareamento (Tanel) entre 65oC e
55oC, reduzindo a temperatura em 1oC a cada 2 ciclos, durante 20
ciclos. Fazer mais 10 ciclos a 55oC
 PCR Gradiente – permite ajuste preciso da Tanel:
Exemplo: Correr uma série de reações com diferentes Tanel no mesmo bloco considerando-se a temperatura média de anelamento e a faixa de variação – 61oC ± 10oC
 Nos ciclos iniciais da PCR a proporção primer-template deve ser 107 (excesso de primer): para amostras muito diluídas (100 cópias de template ou menos) há risco de formação de dímeros de primers (*).
Booster PCR – inicia-se a reação com concentração menor de primer e após alguns ciclos eleva-se a concentração
*
• Primers de um par devem ser usados na mesma concentração
• Excesso de primers induz a formação de produtos inespecíficos e formação de dímeros de primers
*
Condições de ciclagem
• A duração da etapa de extensão (72ºC) deve ser calculada em função do tamanho do produto que se deseja amplificar
• Em geral utiliza-se 1 min/kb de produto – mais do que suficiente pois a extensão terá início durante a etapa de pareamento e durante a elevação da temperatura até 72ºC
*
PCR convencional – Three step
1- Denaturação inicial – 2-3min a 95ºC
2 – Denaturação, 15s a 95ºC
3 – Paremento, 15s a xoC (x depende da Tm)
4 - Extensão, x min a 72ºC
(x depende do tamanho do produto 1min/kb)
5 – Voltar ao passo 2 por 29-39 ciclos adicionais
Two step – alta especificidade,
menor tempo de ciclagem Primer Tm > 65ºC
1- Denaturação inicial – 2-3min a 95ºC
2 – Denaturação, 15s a 95ºC
3 – Paremento e Extensão simultâneos, x min
a 68ºC – x depende do tamanho do produto
(1min/kb)
4 – Voltar ao passo 2 por 29-39 ciclos adicionais
*
Íons Mg2+ são necessários para estimular a enzima Taq DNA polimerase
*
Otimização da [Mg2+]: Efeitos da variação de Mg2+:
*
INIBIÇÃO DA PCR
• Contaminantes da amostra de DNA podem inibir fortemente a PCR
Inibidores da DNA polimerase:
- Fenol
- Proteinase K
- Agentes quelantes em excesso (EDTA)
- Elevadas concentrações de sal
- SDS
*
*
MÉTODOS QUE EMPREGAM A PCR:
• RAPD – Random amplified polymorphic DNA
• AFLP – Amplified fragment length polymorphism
• Multiplex-PCR
• PCR-RFLP
• Long-PCR
• RT-PCR (Reverse Transcriptase)
• RT-PCR (Real Time) - quantitativo
*
Extração de DNA de células sanguíneas
Centrifugar, extrair e descartar
o plasma, com o cuidado de
Não remover a faixa de células brancas.
*
Extração de DNA de células sanguíneas
Extrair cuidadosamente 200ul da região de células brancas
E separar em tubos identificados
*
Extração de DNA de células sanguíneas
Adicionar
Protease a 
Cada tubo
Adicionar 
Tampão de
Lise em cada
tubo
*
Extração de DNA de células sanguíneas
Realizar
Homogeneização
Criteriosa do 
material
*
Extração de DNA de células sanguíneas
Incubar os tubos
A 56C por pelo
Menos 10min.
*
Extração de DNA de células sanguíneas
Centrifugar os tubos
para retirar quaisquer
grumos
Adicionar etanol para lavagem
e centrifugar de novo.
*
Extração de DNA de células sanguíneas
Adicionar as amostras em colunas de afinidade e 
centrifugar .
*
Extração de DNA de células sanguíneas
Tubo com coluna
A coluna vai ser retirada
e adaptada em outro tubo
no qual será feita a eluição
Coluna.
Esse eluato (flow
through) será
Descartado.
*
Extração de DNA de células sanguíneas
A coluna será colocada em um novo tubo, aonde será
Lavada mais duas vezes com tampão, para retirar quaisquer
Moléculas que não estejam ligadas fortemente a coluna.
*
Extração de DNA de células sanguíneas
A coluna com o tubo é então centrifugada
Mais uma vez, para remover excesso de
Tampão de Lavagem.
O próximo passo é adicionar Tampão de Eluição
Incuba-se por 30 minutos a 25ºC
O eluato da coluna é então guardado, pois agora esse contém o DNA Alvo.
*
Extração de DNA de células sanguíneas
Então pode-se preparar o mix de PCR.
Mix de PCR
10x Buffer - 10 µl
MgCl - 6 µl
dNTPs- 0.8 µl
Primer forward - 2 µl
Primer reverse - 2 µl 
Taq polimerase - 0.5 µl
H2O estéril - 73.7 µl 	
*
Extração de DNA de células sanguíneas
Adicionar ao mix de PCR a amostra de DNA em tubos
Específicos e colocar em termociclador.
*
*
*
Preparo do gel de agarose
*
*
Extração de DNA de células sanguíneas
Análise do produto de PCR.
*
DERIVAÇÕES DA PCR
• RT-PCR – PCR para RNA
• Nested-PCR – Iniciadores internos
• PCR Multiplex – Vários iniciadores
• LSSP-PCR – PCR em baixa estringência com um só
iniciador
• PCR competitivo – utilização de um DNA conhecido
de concentração conhecida que compete com o DNA
molde a ser identificado
• PCR em Tempo Real (Real Time PCR) –
visualização da reação de PCR com possibilidade de
quantificação através de um termociclador acoplado
a um espectrofotômetro.
*
FATORES QUE INFLUENCIAM OS
RESULTADOS DE PCR
• Tamanho e composição dos iniciadores
• Temperatura de ligação
• Concentração do DNA molde
• Concentração de MgCl2
• Número de ciclos
• Presença de contaminantes
• Eletroforese
*
Bibliografia
Alberts, Brown,Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter. Use of PCR in Forensic Science. 1998. Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available http://www.accessexcellence.org/AB/GG/
 forensci_PCR.htm.l
Brown, John C. What The Heck Is PCR? 1995. Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available
 http://falcon.cc.ukans.edu/~jbrown/pcr.html
Photographs: Courtesy of UMC clinical lab and Tom Wiggers.
*
Bibliografia
Ronald H. Holton, Ph.D.:
Molecular Diagnostics in the Clinical Laboratory
Molecular Biology in the Clinical Laboratory
Molecular Pathology: Basic Methodologies and Clinical Applications
Expanding applications of PCR, by Peter Gwynne and Guy Page
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*