RNA interferência

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29/09/13 RNA interferência
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Interferência de RNA Apontamentos e texto/figuras da aula
(10-09-2009)
 
 
Alguns apontamentos preliminares:
 
Como em outras áreas da Genética Molecular, a interferência de RNA deu aos seus descobridores o Nobel.
 
Um artigo em português sobre iRNA
Ricerte Filho, JCM & Kimura, ET (2006) - MicroRNAs: Nova Classe de Reguladores Gênicos Envolvidos na Função
Endócrina e Câncer. Arq Bras Endocrinol Metab vol 50 nº 6: 1102-1107
http://www.scielo.br/pdf/abem/v50n6/a18v50n6.pdf
 
Outro artigo em português sobre o assunto
Barbosa, AS & Lin, CJ (2004) - Silenciamento de Genes Com RNA Interferência: Um Novo Instrumento Para
Investigação da Fisiologia e Fisiopatologia do Córtex Adrenal. Arq Bras Endocrinol Metab vol 48 nº 5: 612-619
http://www.scielo.br/pdf/abem/v48n5/a05v48n5.pdf
 
link para um paper on-line relativamente didático (em inglês)
 http://www.biolsci.org/v05p0097.htm
 
Link para fazer o download do vídeo de animação da revista Nature sobre iRNA
http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html
 
link para uma lista grande de tópicos sobre o assunto:
http://www.dmoz.org/Science/Biology/Biochemistry_and_Molecular_Biology/Gene_Expression/RNA_Interference/
 
 
Informações sobre iRNA na Wikipedia (muito bom, cheio de referências)
http://en.wikipedia.org/wiki/RNA_interference
 
Link para NOVA ScienceNOW sobre aplicações médicas antevistas para iRNA
http://www.pbs.org/wgbh/nova/sciencenow/3210/02-cure.html
 
Imagens das apresentações de aula, com comentários
 
O processo de interferência de RNA, que leva à clivagem de um mRNA específico
ou ao bloqueio da síntese de proteínas a partir deste mRNA, pode começar
a) pela injeção de um RNA fita dupla (dsRNA, do inglês double strand RNA)
b)pela síntese de um RNA que forme um longo grampo (a partir da transcrição de um
trecho de DNA genômico ou de um transgene, engenheirado para isso e inserido no
genoma do organismo), ou
c) pela síntese de um RNA de interferência, que será clivado pela enzima Drosha no
núcleo, gerando um grampo que será, no citoplasma, clivado de nvo pela enzima Dicer.
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Na figura ao lado
está mostrado como o
transcrito primário
de um gene para
miRNA (microRNA)
presente no núcleo
de uma célula é
clivado pela enzima
Drosha e o grampo
gerado (que tem duas
bases sobrando na
extremidade 3 ,´
formando o chamado
3´-overhang) é
exportado do núcleo
para o citoplasma.
 
É interessante notar
que o gene para o miRNA (que não está mostrado, mas evidentemente faz parte do
genoma) não leva à produção de nenhuma proteína. Por isso, ele não tem a
configuração típica de um gene, com um quadro aberto de leitura (se não tiver
introns) ou com exons e introns. Ele também pode ser bem pequeno. Por isso, muitos
destes genes passaram despercebidos por todas as buscas de genes feitas na
maioria dos genomas. Eles só começaram a ser descobertos depois da demonstração,
por Fire e Mello, do princípio da interferência de RNA e, sobretudo, depois que se
mostrou que este era um sistema de controle de expressão gênica encontrado em
muitos organismos.
 
Com isso, o número de novos genes nos genomas já sequenciados tem crescido. E o
conceito de gene como um segmento de genoma que codifica uma proteína tem que
ser definitivamente revisto e ampliado para conter estes genes, que codificam
apenas pequenos RNAs que modularão a expressão gênica, através da clivagem do
mRNA contra o qual são dirigidos.
 
Quando se gera um RNA fita dupla no citoplasma (por qualquer um dos 3 caminhos
citados acima), as enzimas Dicer (picotador, em inglês) vão cortá-lo em pelo menos
um fragmento de 21 pb, de novo com um overhang 3´de 2 bases em cada fita (a
figura sugere isso), Diferentes grupos de seres vivos têm diferentes Dicer. Os
mamíferos parecem só ter uma enzima Dicer, a drosófila tem duas (veja mais
embaixo a terceira figura). Os pequenos fragmentos de dsRNA são então carregados
num complexo enzimático formado pela enzima Argonauta e algumas outras enzimas,
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como uma helicase
e uma enzima com
domínio ligador de
dsRNA, chamada
R2D2. Um das
subunidades leva
embora uma das
fitas de RNA e a
outra (em geral a
complementar ao
mRNA alvo da
futura clivagem)
fica. Há um
mecanismo de
instabilidade da
região 5 ´ do
dsRNA que
favorece a
permanência da
fita complementar
no complexo, isto
ainda está sendo
mais investigado.
Na figura ao ldo, a
fita complementar
está representada
em vermelho, ligada à proteína Argonauta. Esta ligação é muito forte.
 
O passo seguinte do caminho para a interferência é o pareamento entre o RNA fita
simples contido no Argonauta e o mRNA alvo, A probabilidade de um pareamento
errôneo é muito remota, já que é preciso que haja o pareamento exato de pelo menos
19 das bases. Assim que o pareamento for feito, duas coisas podem ocorrer:
a) se o mRNA não estiver sendo traduzido, ele será clivado (lado esquerdo da parte
de baixo da figura ao lado).
b) se o mRNA estiver sendo traduzido, o Argonauta se liga a ele e leva a um bloqueio
da tradução.
Em ambos os casos não vai haver mais a síntese de proteínas a partir do mRNA. Este
é exatamente o objetivo da interferência de RNA.
 
Há alguns outros passos que não estão mostrados na figura ao lado, mas aparecem
na animação da Nature. Um dos mais importantes é o destino dos dois fragmentos de
RNA gerados pela clivagem. O fragmento terminal (3 )´ será imediatamente
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degradado pelas RNAses 5´-3 ´da célula. O fragmento da direita (5 )´ também pode
ser degradado pelas RNAses, mas por aquelas que agem no sentido 3´-5 .´ O outro
destino é mais curioso: ele pode ser transformado em fita dupla pela RNApolimerase
RNA dependente! Agora, um longo dsRNA vai estar disponível outra vez para a
enzima Dicer. Cada novo pedaço gerado pode servir para carregar outro Argonauta
ou ainda, quando espontaneamente se separam as duas fitas, a complementar ao
mRNA pode parear com ele e servir de "primer" para a mesma RNApolimerase,
embora ela não precise sempre de primer. Estes eventos estão mostrados na
animação. Fica óbvio, pelas descrições acima, que o processo de interferência de
acentua à medida que vai acontecendo, porque novos fragmentos ativadores da
interferência vão sendo gerados, como numa reação em cadeia, até que o último
mRNA seja degradado. Em muitos organismos, a interferência se espalha de uma
célula para a outra, tomando o organismo todo, rovavelmente pela passagem de
pequenos dsRNA pelas membranas. Os dsRNA são muito mais resistentes às RNAses
em geral do que os RNAs fita simples e por isso têm mais chance de transitar entre
células sem serem degradados.
 
Terceira figura
(à esquerda):
diferentes vias e
diferentes Dicer
em drosófila,
verme (C.
elegans) e
mamíferos.
 
Na sala de aula
no dia 9 de
setembro de
2009
comentamos que,
nos mamíferos,
não havia
evidência de
existência de
uma RNA
polimerase RNA
dependente e
que, portanto, a via de degradação do fragmento de mRNA do lado esquerdo da
clivagem (o fragmento 5 )´ era a mais provável neste grupo de organismos. Pois na
última edição da Nature (NATURE| Vol 461| 10 September 2009), disponível um dia
depois da aula, Maida e cols. mostram que a sub-unidade catalítica da telomerase,
denominada TERT, e que era conhecida por sintetizar DNA a partir do RNA molde da
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telomerase, pode, quando associada a outra proteína (RMRP), ter uma clara ação de
RNApolimerase RNA dirigida (RdRP), agindo na geração de dsRNA e ativando 
sistema de interferência de RNA!!!! O paper pode ser acessado em:
http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7261/pdf/nature08283.pdf
 
Há um grande número de aplicações potenciais do mecanismo de iRNA, tanto para pesquisa como
em produtos e serviços. Um dos mais interessantes é a geração de plantas transgênicas
resistentes a vírus, porque se pode restrinir a replicação viral nestas plantas sem produzir uma
única proteína nova, apenas um dsRNA dirigido contra um mRNA importante do vírus. Outras
aplicações podem ser encontradas nos papers e links fornecidos no início desta página
 
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