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Ferramentas de genética molecular
Obstáculos encontrados na análise de sequências individuais do RNA ou DNA: como obter uma quantidade suficiente? Como purificar a sequência desejada?
Solução: clonagem molecular e PCR.
Clonagem molecular: isolamento de um gene em particular ou de outra sequência do DNA e obtenção de múltiplas cópias.
Tecnologia do DNA recombinante: transferência de um segmento para um microrganismo que cresce reproduzindo a sequência juntamente com o seu próprio DNA.
Enzimas de restrição clivam sequências palindrômicas específicas do DNA. Originam fragmentos que possuem uma “cauda” de uma só cadeia. Cria extremidades coesivas (sticky ends) que possibilitam a formação de combinações com DNAs de diferentes espécies. Algumas clivam ambas as cadeias no mesmo ponto, originando extremidades nas quais todos os nucleotídeos se encontram emparelhados.
Vetores: é uma molécula de DNA capaz de se replicar autonamente num hospedeiro, como as células bacterianas ou leveduras, a partir do qual pode ser isolada, numa forma pura para análises.
Características essenciais dos vetores: DNA dupla-fita, ao menos um sistema de seleção, sítios de clonagem únicos para enzimas de restrição, replicação na célula hospedeira.
Características desejáveis: variedade de sistemas de seleção, baixo peso molecular.
Exemplos de vetores: plasmídeos, bacteriófagos.
Extração do plasmídeo: adicionar à solução álcali (pH alto desnatura o DNA); adicionar ácido para neutralizar álcali (DNAs tendem a se renaturar); o DNA desnaturado é pouco solúvel em água e precipita (é o caso dos fragmentos grandes de DNA cromossômico que não conseguem se renaturar); o DNA plasmidial renatura-se (é o sobrenadante solúvel em água).
Inserção do fragmento de DNA no vetor: ambos são clivados com a mesma enzima de restrição, enzima DNA ligase une as extremidades compatíveis dos 2 DNAs.
Como o DNA entra na bactéria: por transformação. De forma passiva após o tratamento da membrana com cloreto de cálcio ou de forma ativa por choques elétricos (eletroporação). Processo de baixa eficiência podendo levar a 5 formações. (o desejado, plasmídeo vazio, união dos insertos – não contém origem de replicação, união de dois ou mais plasmídeos (acaba desaparecendo ao longo do tempo),um plasmídeo e vários insertos (é instável).
Seleção: os plasmídeos comprados são construções com todas as sequências conhecidas. Ex: gene amp ou tet, conferem resistência a ampicilina e tetraciclina (pBR322). Se o fragmento entrar em alguns desses genes, ele não será mais ativado bactéria sensível ao antibiótico correspondente. Ou pUC22 (colônias carregando o plasmídeo com inserto não vou degradar o substrato por não produzirem a β-galactosidase).
Um dos vetores mais utilizados é o bacteriófago lambda, que se comporta como um vírus da E.coli. possui dois ciclos: lítico (rico em nutriente) e lisogênico (pouco nutriente). Contém DNA duplo e linear, que assume a forma circular quando entra na célula hospedeira. No ciclo lítico, os genes envolvidos no processo de lisogenia são dispensáveis, e, portanto o genoma do fago pode ser substituído por outro fragmento de DNA, sem que haja alterações nos processos envolvidos na via lítica.
Biblioteca: é uma coleção de clones, em que cada clone transporta moléculas vetores nas quais um fragmento diferente do DNA foi inserido.
Biblioteca de DNA genômico: contém fragmentos de DNA gerados com o emprego de enzimas de restrição. Para encontrar o fragmento de interesse, transferir o conteúdo do meio para o filtro de nitrocelulose, e sonda marcada radioativamente vai se ligar ao fragmento desejado lavar o papel, e auto-radiografia vai localizar o clone desejado (marca a posição onde a sonda se ligou).
Bibliotecas de cDNA: armazenam cópias da população de mRNA presentes em um tecido em particular. cDNA produzido a partir do mRNA com a transcriptase reversa. Vantagens: o cDNA contém apenas os éxons, e podem diferir quanto ao mesmo gene devido ao splicing alternativo. Desvantagens: não fornece informações sobre o tamanho do gene.
Extração do mRNA: cadeias curtas de timina são ligadas a bolinhas de oligo (dT) celulose e são grudadas em uma coluna. O RNA eucariótico é passado pela coluna e o mRNA fica retido (por causa da cauda poliA); o mRNA é removido por tratamento com um tampão.
Sondas moleculares de ácidos nucleicos: utilizadas para identificação do clone de interesse (triagem da biblioteca). Realizada por meio da hibridização de ácidos nucleicos usa-se outro fragmento de DNA com sequência complementar à do fragmento desejado (ocorre anelamento, formando uma dupla-hélica estável). A sequência conhecida é marcada com compostos radioativos ou corantes fluorescentes para permitir que ela seja subsequentemente detectada.
Como obter as sondas? Se a proteína é conhecida, RNA complementar já foi estudado em outras espécies, e a sequência pode ser semelhante. À partir da sequência de aminoácidos e códons, e testar sondas.
Southern blotting: é o método padrão utilizado para examinar fragmentos particulares de DNA clivados pelas enzimas de restrição.
Etapas do SB: DNA de interesse é isolado; clivagem com endonucleases de restrição; separação por eletroforese; DNA desnaturado com uma base forte; transferência por capilaridade dos fragmentos do gel para uma membrana de nitrocelulose; incuba-se sonda complementar à sequência de interesse; filtro lavado para remover sonda não ligada; exposição do filtro ao raio X para revelar a posição dos fragmentos.
Desvantagens da SB: capacidade de identificar mutações limitadas (sonda só vai detectar mutações com efeito considerável sobre o tamanho do fragmento).
Oligonucleotídeos alelo específicos: melhor sonda para se identificar uma única substituição de bases; o pequeno tamanho a torna mais sensível, e ela só se anela a sequência complementar normal. Possibilidade de identificação de mutações específicas de alguns genes (anemia falciforme, fibrose cística, mutações conhecida em membros da família).
Na maioria dos casos, os genes mutantes causados por mudanças pequenas no DNA não são distinguíveis dos genes normais segundo análise pelo Southern Blot, realizada com emprego de sondas DNA padrão.
Northern: abordagem padrão para determinar o tamanho e a abundância do mRNA a partir de um gene específico de um tecido.
Vantagens do Northern: já está fragmentado, não precisa desnaturar, são naturalmente de tamanhos diferentes.
Western blot: análise de alterações das proteínas codificadas pelos genes. Extração das proteínas de extratos celulares, separação por eletroforese, transferência para membrana, incubação da membrana com anticorpos e depois com anti-anticorpos com marcados detectável (fluorescente ou radioativo).
PCR: é capaz de amplificar seletivamente uma sequência de DNA de interesse diversas bilhões de vezes em poucas horas. É uma amplificação enzimática de um fragmento alvo de DNA localizado entre dois iniciadores (primers).
Primers são flanqueadores à sequência-alvo.
Coloca-se no termociclador: extração do DNA + primers + nucleotídeos + taq polimerase (DNA polimerase termorresistente).
Passos: desnaturação em alta temperatura; diminuição da temperatura – primer se anela à sequência complementar (estão em muito maior quantidade do que o DNA que tende a tentar se parear também); aumento da temperatura – ativação da taq polimerase adiciona os nucleotídeos, ocorrendo duplicação das fitas. A cada ciclo, o número de fragmentos aumenta em progressão geométrica, e os fragmentos desejados começam a se tornar maioria, ao invés das cópias de comprimento maior que também são formadas.
Utilidades da PCR: na análise de pequenas amostras de RNA utilizando a transcriptase reversa; sequenciamento do fragmento; submeter a ASO para identificar mutações; obter muitas cópias para determinado fragmento, medicina forense, diagnóstico de doenças, teste de paternidade.
Vantagens da PCR: método sensível, barato, requer pouca amostra do paciente.
PCR em tempo real: utilizada para medir a quantidade de uma
sequência de DNA de uma amostra. O número de ciclos necessário para atingir um dado limiar é a medida da quantidade de molde que estava presente no início da PCR quanto menos ciclos forem necessários, mais moldes havia no começo da reação. Medida de fluorescência emitida pelos compostos à medida que se formam software para análise dos dados.
Sequenciamento do DNA: uma sequência alvo é amplificada usando-se nucleotídeos normais e especiais (didesoxinucleotídeos) que quando incorporados em um filamento crescente d DNA não permitem que seja acrescentado outro nucleotídeo na sua extremidade, terminando a cadeia naquele ponto (por não apresentarem o OH- na extremidade 3’ da pentose). Estes são marcados por fluorescência ou radiação.
No sequenciamento após a eletroforese e auto-radiografia, a ordem dos nucleotídeos pode ser visualizada e obtida diretamente, partindo da parte inferior para a superior do gel obtém-se a sequência 3’-5’ (sequência complementar). No método automatizado, utiliza-se simultaneamente os 4 didesoxinucleotídeos marcados por fluorescência (fluorocromos diferentes), e softwares leem sequencialmente e identificam os produtos.
Micro arrays: produção de microarranjos com milhares de sondas, analisadas em uma amostra simultaneamente. Cada sonda ocupada uma posição definida e conhecida (princípio dot blot). Sistema de computador mede a quantidade de RNA ou DNA hibridizadas com cada sonda, analisando a quantidade de radioatividade ou fluorescência de cada spot. Pode ser utilizada para se estudar a expressão gênica em diferentes tecidos.
Hibridização comparativa do genoma – usada para medir a diferença entre duas amostras de DNA; pequenas deleções ou inserções que não são captadas pela análise normal dos cariótipos. Cada amostra é marcada com um corante diferente e são hibridizadas num chip de microarranjos. A. Ganho: DNA controle não hibridiza; B. Deleção: nenhuma sequência do DNA do paciente hibridiza com determinada sonda. C. Mesmo padrão: sequência complementar à sonda presente tanto no DNA controle quanto no paciente.
Analisar a abundância de um número grande de RNAs simultaneamente de um determinado tipo celular. Obtenção de cDNA marcados com fluorescência, e a proporção de fluorescência de cada spot é a medida da abundância de cada RNA na amostra teste.
O emprego dos micro arranjos permitem o estudo da genômica funcional e o estudo de genomas inteiros. Há chips gênicos que podem conter mais de 10.000 sondas em uma placa de silicone de poucos centímetros.
Metade do comprimento linear do DNA consiste de cópias únicas, e a outra metade é DNA repetitivo (regiões muito utilizadas para medicina forense, testes de paternidade, criminalística e genética evolutiva; são regiões que acumulam mutações. O DNA repetitivo pode ser de sequências agrupadas ou sequências dispersas.
DNA repetitivo agrupado: repetições curtas organizadas em tandem (correspondem ao DNA satélite). Diferente no tamanho da sequência e do total.
DNA repetitivo disperso: poucas famílias, mas compõem uma parte significativa do genoma. Está relacionado aos transposons – geram cópias de si mesmo que podem se integrar no genoma. Família SINE, Família LINE.
Marcadores moleculares são derivados de pequenas regiões de DNA que apresentam polimorfismos entre indivíduos dentre de uma mesma espécie. Podem ser: SNP (mutações de ponto), Indel (inserções ou deleções) ou CNP (presença ou ausência de segmentos).
RFLP – polimorfismos de fragmentos de restrição: mudanças no DNA genômico levam a criação ou eliminação de sítios de restrição alteração no tamanho dos fragmentos de DNA formados. Dependendo dos alelos, indivíduo pode ser homozigoto ou heterozigoto (marcadores codominantes). Polimorfismo deriva de mutação pontual, inserção ou deleção.
Metodologia do RFLP: extração do DNA; digerir o DNA em fragmentos pequenos; separação por eletroforese; transferência para o filtro; visualização dos fragmentos com sondas; análise dos resultados. Diferença em padrão de bandas reflete diferenças genéticas.
Vantagens da RFLP: marcador reprodutível, marcadores codominantes (pode analisar os dois alelos), técnica simples. Desvantagens: trabalhoso, caro, uso de sondas radioativas (risco e custo). Pode ser usado para teste de paternidade
VNRT: marcadores baseados em locos hipervariáveis de minisatélites. Polimorfismo resulta das diferenças do número de sequências repetidas. Essas sequências repetitivas são altamente variáveis porque podem fazer com que haja pareamento errado de homólogos por terem regiões iguais que se reconhecem; assim, pode ocorrer crossing-over gerando fragmentos de tamanhos diferentes.
Técnica VNRT: extração do DNA; endonucleases; eletroforese; sondas; análise do tamanho dos fragmentos (reflete o número de repetições). Dois tipos de sondas podem ser utilizados: 1) sonda unilocos: geralmente reconhece sequência lateral e não a repetitiva, sempre marca apenas duas bandas (um alelo materno e outro paterno), bem específica. 2) sonda multilocos: analisa essa repetição pelo genoma inteiro, homóloga à região repetitiva e gel parece código de barras.
Microssatélites: sequências simples repetidas (SSR) ou curtas sequências em tandem (STR). De um a quatro nucleotídeos repetidos. São mais frequentes e melhor distribuídos do que os minissatélites. São muito similares aos VNTRs, mas diferem no tamanho e comprimento das unidades em tandem. São muito abundantes no genoma humano, e cada um deles possui um grande número de diferentes alelos (inclusive maior que os VNTRs), o que os torna ainda mais úteis para identificação humana.
São analisados por PCR, com primers que flanqueiam o microssatélite. Não é necessário usar sonda, apenas corar gel pois só vão ser coradas as regiões que foram amplificadas.
RAPD – amplifica sequências anônimas de DNA usando primers arbitrários (únicos). É um método rápido para detecção de polimorfismos: comparar espécies e indivíduos diferentes. O marcador é dominante (analisa se tem ou não aquela banda). Problemas: não tem reprodutibilidade, problemas de interpretação. Vantagens: baixo custo, rápido e simples.
Mapeamento
As chances de ocorrência de crossing over vão depender da distância entre os genes. Quanto mais próximos, menor a chance. Quando estiverem muito longe um do outro, a segregação vai ocorrer de forma praticamente independente.
Identificação dos genes que causam doença é o foco central da genética médica. Importante para prevenção, tratamento e diagnóstico de doenças genéticas.
A localização é a primeira etapa para a clonagem de um gene. Uma vez clonado, seu sequenciamento e seu produto proteico podem ser estudados.
Mapeamento genético: frequência de crossing meióticos entre os locos é usada para estimar a distância entre os locos. São baseados na genética da recombinação. Fornecem uma localização aproximada dos genes com relação aos genes conhecidos.
Segregação independente: locos gênicos em cromossomos independentes. Diferentes combinações nos gametas com proporções iguais (1:1:1:1)
Ligação: locos gênicos situados no mesmo cromossomo. Nos genes ligados a frequência recombinante é menor que 50%. 
θ = proporção de gametas recombinantes, varia de 0 a 0,5.
A chance estatística de que dois locos estejam ligados pode ser medida pelo LOD. Normalmente um loco é conhecido (marcador) e queremos saber se o outro está ligado. O valor LOD > 3,0 é tido como evidência de ligação.
LOD = Z = log (p ligados/p não ligados).
Associação dos valores LOD com outras famílias pode ser evidência definitiva de ligação.
Para ser útil no mapeamento gênico os marcadores ligados devem ser codominantes, numerosos e altamente polimórficos. Um alto grau de polimorfismo aumenta a probabilidade de que as reproduções sejam informativas.
Limitações do mapeamento genético: nem sempre corresponde às distâncias físicas entre os genes. Esta correlação se complica por diferenças nas taxas de recombinação entre os sexos.
Mapeamento físico é baseado na análise direta do DNA situam genes em relação a distâncias medidas
em número de pares de bases. Possuem maior resolução e são mais precisos que os mapas genéticos.
Hibridização in situ (FISH) – avalia a presença/ausência de uma sequência de DNA em particular; avaliar o número ou a organização de um cromossomo ou de uma região cromossômica. Sondas específicas para cromossomos individuais, regiões cromossômicas ou genes podem ser utilizadas para identificar rearranjos cromossômicos particulares ou para diagnosticar a existência de aneuploidias (não tem o número de cromossomos normal).
Análise do cariótipo: montar cultura celular (ex: de linfóticos) capaz de crescimento rápido, com agente que vai induzir a multiplicação; incubar por 72h; colocar colchicina – pára a divisão celular na metáfase (máxima condensação, melhor fase para estudar); colocar as células em solução hipotônica de NaCl – células inflam; colocar na lâmina; coloração; realizar o cariograma ou cariótipo. 
Técnica de hibridização: obtenção e marcação da sonda com compostos fluorescentes; lâmina passa por um preparo para que o DNA se desnature; hibridização da sonda – se anela à região complementar a ela; visualização no microscópio. Podem ser utilizados fluorocromos diferentes para detectar diferentes sondas simultaneamente. Podem ser utilizadas sondas específicas para um loco gênico, para um DNA repetitivo, para cromossomos inteiros ou braços.
Cariotipagem espectral – uma combinação variada de cinco sondas fluorescentes diferentes em um conjunto com câmeras especiais e programas de processamento de imagens. Cada cromossomo cora-se de uma cor diferente.
Clonagem gênica funcional de gene candidato – proteína conhecida que é responsável pelo distúrbio herdado, ou uma proteína que é considerada provável candidata. O produto gênico às vezes é conhecido antes que o próprio gene seja identificado. Deduzir a sequência de nucleotídeos a partir da sequência de aminoácidos da proteína, a partir dos menos degenerados e examinar banco de dados.
Ex: síndrome de marfan análise de ligação negativa para o colágno; gene para fibrilina mostrou ligação (é responsável pela força contrária do crescimento).
Clonagem posicional e os sítios de sequência marcada (STS) – como localizar um gene em uma região com muitos genes? Quando não se sabe nada sobre o produto gênico que é responsável por uma doença. Começar com um marcador ligado e pesquisar a região vizinha. Construção de um mapa contig.
Mapa contig = série de fragmentos de DNA que se superpõem parcialmente, formando uma sequência contínua de DNA, para andar ao longo da região, até ser atingido o gene da doença.
Cada fragmento é referente a uma parte da sequência análise computacional “une” os fragmentos.
Etapas da clonagem posicional: gene mapeado em uma região específica de um determinado cromossomo (análise de heredogramas); gene localizado no mapa físico destA região do cromossomo; sequenciamento do gene para encontrar as mutações.
Andar no cromossomo: gene de interesse próximo ligado a um marcador; os mapas de restrição são construídos para clones superpostos, o fragmento mais distal da sonda é usado para triar uma segunda biblioteca genômica construída pelo emprego de uma enzima de restrição diferente. É construída uma sonda com base no marcador para a ligação (sua sequência é conhecida). Sonda marca fragmento maior, mais próximo do gene, ao triar uma biblioteca genômica. É construída outra sonda baseada na parte distal deste outro fragmento, e feita a triagem de outra biblioteca. Assim, ocorre a marcação de fragmentos cada vez mais próximos do gene.
Exemplo de gene de doença que foi mapeada e clonada: produto gênico: inibidor de serina protease, doença deficiência de α1 antitripsina. Localização cromossômica: 14q.