aula diagnóstico 2010

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 Determinar a etiologia e acompanhar o curso de uma 
infecção viral
 Diferenciar viroses com sintomas semelhantes
 Diagnosticar doenças congênitas
 Determinar o prognóstico ou a conduta a ser tomada 
com o paciente
 Avaliar a eficácia do tratamento antiviral
 Avaliar a resposta vacinal
 Triagem de sangue em bancos de sangue
 Estudos de soroprevalência
Importância do diagnóstico 
laboratorial virológico
Métodos de diagnóstico laboratorial
Detecção de antígenos 
virais
Isolamento viral
MÉTODOS DIRETOS
Detecção do genoma 
viral
Pesquisa de anticorpos
(sorologia)
MÉTODOS 
INDIRETOS
Métodos de diagnóstico laboratorial
Coleta e transporte de espécimes para 
diagnóstico
Métodos de diagnóstico laboratorial
Isolamento viral
MÉTODOS DIRETOS
Isolamento viral
Sistemas celulares::
 Vantagens: alta sensibilidade, 
método padrão de diagnóstico, 
permite a detecção de um vírus 
desconhecido
 Desvantagens: método lento, 
alto custo e realização complexa
Metodologia:
1.Tratamento de espécimes clínicas e inoculação em cultura 
celular
2.Reconhecimento da replicação viral (efeito citopático)
HSV. A, células Vero não infectadas. 
B, após infecção por HSV-1, 
mostrando células arrendondadas, 
células multinucleadas e perda da 
monocamada
LISE CELULAR
Metodologia:
1.Reconhecimento da replicação viral (efeito citopático)
HSV
RSV
Vírus do sarampo
SINCÍCIOS
A confirmação da identidade viral pode ser 
realizada por meio de testes de neutralização, HI, 
imunofluorescência, ELISA ou técnicas moleculares
3. Identificação do vírus isolado (técnicas imunológicas)
Tipos de cultivos celulares
 Primária Linhagem 
diplóide 
Linhagem contínua 
Origem Preparado a 
partir de tecido 
fresco 
 
Cultivo primário 
resistente a 
repique 
Tumores/tecido 
normal (diplóide) 
transformado in 
vitro. 
Morfologia Morfologia do 
tecido original 
 
Fibroblastóide Epitelióide 
Cariótipo Diplóide Diplóide Aneuplóide (n, 3n, 4n, 
etc). 
Vantagens Alta sensibilidade 
Utilizadas para 
isolamento e 
produção de 
vacinas 
Utilizadas para 
isolamento e 
produção de 
vacinas 
 
Propagam 
indefinidamente in 
vitro  perderam a 
inbição de contato 
Utilizadas para 
isolamento 
Desvantagens Maior dificuldade na 
obtenção 
Baixa resistência a 
repiques  morrem 
após 2 ou 3 
passagens 
 
Infecção por vírus 
adventício 
Não podem ser usadas 
no preparo de vacinas 
Infecção por vírus 
adventício 
 
Preparo de cultivo primário
Obtenção e preparo 
do tecido
Tratamento dos 
fragmentos do tecido com 
Tripsina
Obtenção de uma 
suspensão celular
Adição da suspensão celular 
as garrafas de cultivo
Formação da monocamada
Adição do meio de 
cultivo
Observação de cultura celular ao 
microscópio ótico invertido
Manutenção do 
cultivo celular: 
passagens ou repiques
Microscopia eletrônica
 Baixa sensibilidade (> 106 part/ml)
 Elevado custo do equipamento e manutenção
Fezes Rotavirus, Adenovirus
Norovírus
Astrovirus, Calicivirus
Fluido de vesículas HSV
VZV
Raspados de pele Papilomavirus, 
molusco contagioso
Adenovírus
Rotavirus
Métodos de diagnóstico laboratorial
Detecção de antígenos 
virais
MÉTODOS DIRETOS
Reação de hemaglutinação
Reação de inibição da 
hemaglutinação
RESULTADO:
Imunofluorescência direta
Imunofluorescência indireta
Leitura da imunofluorescência
Imunofluorescência direta
Teste positivo para IF para o 
antígeno do vírus da raiva
Célula epitelial infectada 
pelo HSV
222222222222
Elisa: pesquisa de antígenos 
virais
Elisa: pesquisa de anticorpos
Elisa: resultado
Pesquisa de rotavírus em 
suspensão fecal
Pesquisa de anti-HIV em soro
Pesquisa de HBV em tecido
Western-blot
Western Blot para anti-HIV
• Linha 1: Controle positivo
• Linha 2: Controle negativo
• Amostra A: Negativa
• Amostra B: Indeterminada
• Amostra C: Positiva
Métodos de diagnóstico laboratorial
MÉTODOS DIRETOS
Detecção do genoma 
viral
Hibridização molecular
Identificação de sequências específicas do genoma viral 
por meio de sequências complementares marcadas (enzima 
ou radioisótopo)
Hibridização molecular: 
resultado
Reação em cadeia da polimerase 
(PCR)
Técnica para amplificação de uma sequência 
específica de DNA
Componentes:
- DNA alvo
- DNA polimerase
- Oligonucleotídeos (primers)
- Nucleotídeos
- MgCl2
Reação em cadeia da polimerase 
(PCR)
| Extração DNA/RNA
AMPLIFICAÇÂO 
DNA
Amplificação do DNA
Visualização do fragmento de DNA 
amplificado (amplicon) em gel de agarose
Métodos indiretos/sorológicos
Avaliação da resposta imune humoral
Detecção de anticorpos da classe IgM
 Indica infecção recente para um determinado vírus a 
partir da coleta de uma amostra de soro na fase aguda
Detecção de anticorpos da classe IgG
 Indica imunidade para um determinado vírus 
 Para caracterização de infecção recente, deve-se 
demonstrar a conversão sorológica: aumento no título (4X) 
de anticorpos entre 2 amostras pareadas de soro (fase 
aguda e convalescente)
Perfil sorológico típico após uma 
infecção aguda
Durante a reinfecção o IgM pode estar ausente ou detectável em 
baixos níveis.
Reinfecção
Tempo (semanas)
Título de anticorpos
Aplicação da sorologia no 
diagnóstico de infecções virais
1. Diagnóstico de infecções agudas
• EBV, CMV, HAV, HBV, Parvo B19, Sarampo, 
Rubéola, Cachumba, Dengue
2. Diagnóstico de infecções crônicas (presença de 
Acs indicativa de infecção corrente)
• HCV e HIV
3. Determinação de imunidade (p.ex. pré-natal, 
resposta vacinal)
• CMV, Rubéola, HSV, VZV, Parvo B19, 
Hepatite B, Hepatite A, Sarampo