ok controle pratica 08.09.11

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Alexandra Woods
Controle M. e físico-químico de P de origem animal
08/09/2011 - Prática
Na aula passada vimos a analise preliminar que é feita, que seria o plaqueamento em superfície no meio per parker. Quando faço essa analise no meio per parker, eu não posso afirmar que estou trabalhando com s. aureus, eu desconfio apenas. Quando tenho a formação das colônias características, eu posso saber que eu tenho a possibilidade de estar trabalhando com esse patógeno, mas para isso eu preciso realizar umas provas bioquímicas que vão me confirmar a espécie que estou trabalhando e também vão me confirmar o gênero staphylococcus.
As provas bioquímicas são baseadas na pesquisa de enzimas e de toxinas que os MO produzem.
Geralmente as provas bioquímicas vão pesquisar enzimas ou toxinas específicas daquele MO que eu quero pesquisar.
O que vou fazer:
Minha placa de petri onde cresceram as colônias características, vou pegar na placa de petri e junto como se fosse uma alça de platina, só que alem de ser uma barriguinha é uma haste armada, como se fosse uma agulha. Vou vir com essa minha haste e vou na colônia que tem a característica e vou pescar essa colônia, vou colocar essa colônia num caldo ch. BHI. 
Vou retirar de 3-5 colônias que apresentam as características especificas, que seriam colônias negras com halo claro ao redor, e vou colocar essas colônias dentro de um tubo contendo o caldo BHI. O caldo BHI é ch. Caldo Infusão Cérebro Coração. A sigla BHI é do inglês.
O BHI vai ser um caldo que vou utilizar no momento que eu tiro as colônias características e vou fazer as provas bioquímicas.
O caldo BHI é um caldo de enriquecimento, ou seja, vai dar condições para o meu MO se multiplicar. Ele vai oferecer substrato para o meu MO.
Porque eu preciso replicar minha colônia no caldo BHI antes de realizar as provas bioquímicas?
As provas são baseadas em enzimas ou de toxinas. O momento que meu MO produz a toxina ou a enzima vai ser na fase LOG. A fase LOG é a fase da curva de crescimento bacteriano onde meu MO está se multiplicando intensamente, vai ser a fase onde vou ter a produção das minhas enzimas e/ou toxinas.
Se eu não colocar no caldo BHI eu não consigo estabelecer a fase LOG (potencial de multiplicação) e com isso não vou ter a produção das enzimas ou toxinas que vou pesquisar.
A importância de fazer o pré aquecimento é restabelecer o potencial de multiplicação do meu MO. 
Vou colocar de 3-5 UFC (unidades formadores de colônia) no caldo BHI, vou encubar esse caldo numa tem de 35-37ºC em estufa por 24-48 horas. 
Após esse período o que vou observar: Vou observar que meu líquido vai ficar extremamente turvo com um deposito no fundo. 
Liquido turvo é característica de que meu MO se multiplicou e produziu compostos que deixou aquele liquido turvo.
Ao retirar da estufa vou observar a turvação do meu meio de cultura e isso vai caracterizar o crescimento de MO.
A partir desse caldo BHI é onde vou realizar minhas provas. 
Essa etapa é de fundamental importância, se essa etapa não for feita corretamente eu não vou ter sucesso na minha análise.
1ª prova que vamos fazer:
 - Prova da catalase. 
A prova da catalase tem como objetivo diferenciar os MO presentes do gênero staphylo dos MO que são componentes do gênero streptococcus. Porque o Streptococcus também pode apresentar aquela colônia negra com halo claro ao redor, Então preciso diferenciar.
Essa prova não vai me dizer se é do S.aureus, ele vai apenas me dizer se estou trabalhando com gênero staphylo ou strepto. Ele não me identifica a espécie.
Como faço: 
Pego 0,1ml do caldo BHI e vou colocar na superfície de um meio inclinado ch Agar nutriente inclinado. (Agar = por ser um Agar, é um meio solido). 
Pego esse 0,1ml do caldo e vou tentar espalhar pela superfície do meio.
Uma vez feito isso, vou encubar esse meu tubo que é Agar nutriente inclinado em estufa em temperatura de 35-37º c por durante 24-48 horas.
Quando estou trabalhando com staphylococcus, sempre trabalhamos com essa temperatura de 35-37ºC na incubação.
Vou encubar esse meu tubo de Agar nutriente inclinado, que foi semeado com 0,1ml de caldo BHI. 
Encubei e depois retirei da estufa.
O que estou pesquisando: Estou pesquisando a enzima catalase.
Não vou conseguir visualizar no momento que retirei da estufa se há produção de catalase ou não.
O que eu tenho que fazer: Vou pingar na superfície do meio, gotas de peróxido de hidrogênio, que é a água oxigenada.
Nesse momento, se a enzima catalase estiver presente, vai ocorrer a dissociação do meu peróxido de hidrogênio em oxigênio + hidrogênio. Essa dissociação do peróxido do hidrogênio provocada pela presença da enzima catalase, vai provocar uma efervescência na superfície do meu meio de cultura, essa efervescência na superfície do meu meio de cultura me indica a presença (+) da enzima catalase.
Então quando eu tenho a presença da enzima catalase, eu consigo diferenciar o staphylo do strepto, porque o staphylo é produtor de enzima catalase. Então quando eu tenho efervescência positiva, eu posso estar trabalhando com o gênero staphylococcus. 
Quando não houver a efervescência eu já sei que não é staphylo.
Quando houver a efervescência eu sei que é staphylo.
Se não tenho efervescência, se eu não tenho staphylop, não tenho porque continuar as provas.
Existem 2 gêneros que podem ser produtores da catalase: staphylo ou bacillus
O bacilus ainda existe algumas espécies que crescem com a mesma característica da colônia do staphylo.
A prova da catalase nada mais é do que inocular 0,1ml do caldo BHI em Agar nutriente inclunado, vou encubar esse tubo, vou retirar e vou aplicar peróxido de hidrogênio na superfície do meio. No momento que pinguei, se a enzima catalase estiver presente, ela vai dissociar o peróxido de hidrogênio em oxigênio + hidrogênio e isso vai provocar a efervescência naquele momento. Então é uma prova positiva tanto para o gênero staphylococcus como pro gênero bacillus.
Catalase +: O que vou fazer agora: outra prova para diferenciar o gênero staphylo do bacillus.
Prova do manitol
Objetivo de diferenciar o gênero staphylococcus do gênero bacillus.
Vai ser realizada utilizando um meio de cultura ch de caldo OIF manitol.
Como vou fazer:
Vou pegar 0,1ml do meu caldo BHI, e vou colocar num tubo contendo o caldo OIF manitol. Esse caldo OIF manitol vai possuir o manitol na sua composição que é substrato para staphylo, porem não é substrato para bacillus. Alem disso vai ter na sua composição um indicador de pH ch. “Azul de bromotimol”. Esse indicador de pH azul de bromotimol, em pH acido vai apresentar uma coloração amarela no meio. 
Incubo esse tubo contendo o caldo OIF manitol a uma temperatura de 35-37ºC, por 24-48 horas. Após esse tempo, vou retirar o meus tubos da estufa, e vou observar a coloração. 
Se o gênero staphylococcus estiver presente ele vai consumir o manitol, e no momento que há o consumo do manitol vai haver também a formação de compostos que são ácidos, esses compostos ácidos vão fazer com que meu caldo se torne ácido e com isso vai adquirir a coloração amarela, porque o meu indicador de pH que é o azul de bromotimol em ph ácido ele vai apresentar a cor amarela. 
Caso eu retire o meu tubo da estufa e ele ainda esteja com a coloração de antes (azul) eu sei que não tem staphylo ali, porque não houve consumo do manitol, e com isso não houve degradação do manitol e não houve formação de compostos ácidos, meu pH continuou a mesma coisa, então sei que o staphylo não cresceu.
Por isso que é importante saber o meio de cultura para saber qual o substrato que o meu MO vai utilizar. E isso facilita o meu resultado.
Diferenciamos staphylo de bacillus.
Agora sei que estou trabalhando com o gênero staphylo. 
Vou agora identificar a espécie do meu MO.
Vamos realizar as provas bioquímicas para identificar as espécies:
- Gelatinase
- Coagulase
- Termonuclease
- DNAse.
Tanto a gelatinase quanto a coagulase são enzimas
A termonuclease
e DNAse são toxinas formadas no alimento pelo s.aureus.
Para ser s.aureus, ele precisa apresentar resultado positivo em todas as analises, desde a prova de manitol, até a diferenciação entre o staphylo e estrepto. E nessas provas que vamos falar agora. Deve apresentar resultado positivo em todas as provas bioquímicas.
Gelatinase
A 1ª prova é a prova da gelatinase
Como vou fazer essa prova: Vou retirar 0,1ml de BHI, e vou colocar num tubo de meio de cultura contendo o meio gelatina nutritiva. 
Problema: por ser uma gelatina no meio de cultura, eu não posso autoclavar esse meio de cultura, então pode ocorrer alguma contaminação no momento de preparo.
Como vou fazer para saber se o meu meio de cultura está contaminado ou não? 
Vou trabalhar com tubo semeado com 0,1ml do meu caldo BHI. E vou trabalhar com um tubo controle, que é o tubo que só vai ter meio de cultura, não vai ter nenhuma inoculação da amostra, não vou semear nada, tem só o meio de cultura.
 
Vou agora encubar os 2 tubos em estufa na temperatura de 35-37º por 24-48 horas.
Após a encubação vou retirar os tubos da estufa e vou observar que o meio de cultura vai se apresentar liquefeito. Porem eu não sei qual foi a causa dessa liquefação, se foi pela produção da enzima gelatinase ou se foi pela ação da temperatura de incubação.
O que vou fazer para saber qual foi a causa da minha liquefação do meu meio: 
Preciso colocar esses 2 tubos na geladeira, durante 30 min (meia hora). Então vou retirar da estufa e vou colocar esses 2 tubos na geladeira por 30 min.
Depois de 30 min, vou retirar o meu tubo da geladeira e vou poder ter 3 situações diferentes:
Posso ter situação onde:
- o tubo semeado permanece liquefeito após a geladeira e o Tubo controle volta ao normal.
O que significa isso: depois que tirei meu tubo da geladeira, se meu tubo semeado continua liquefeito e meu tubo controle voltou ao normal, significa que a liquefação do tubo semeado foi oriundo da produção de gelatinase (prova +). Porque se o meu tubo controle estivesse liquefeito, seria porque teria havido contaminação do meu meio, por isso não teve alteração.
Outra situação:
- Posso ter o tubo semeado liquefeito 
Tubo controle também liquefeito: isso significa que houve contaminação. Então eu preciso repetir essa amostra, repetir essa analise. 
Outra situação:
- Se o meu tubo semeado permanecer normal, e meu tubo controle também voltar ao estado normal (voltar ao estado de antes de entrar na estufa), significa que é negativo para a produção da enzima gelatinas. (quando os 2 voltarem ao estado normal, seria negativo para s.aureus, seria a gênero staphylo, porem não da espécie s.aureus)
(Quando retiro da estufa, eu coloco na geladeira por 30 min para observar se essa liquefação ocorreu pela ação da temperatura de incubação ou pela presença da enzima gelatinase)
Prova da coagulase
Depois que eu fiz a prova da gelatinase, eu vou fazer outra prova bioquímica que é a chamada prova da coagulase. Essa prova vai trabalhar o objetivo de pesquisar a enzima coagulase.
Como é feita:
A prova da coagulase vai ser realizada inoculando 0,1ml do caldo BHI em um tubo contendo plasma sanguíneo. 
Como estou trabalhando com plasma sanguíneo, eu não posso autoclavar também, porque se eu autoclavar vai coagular esse plasma sg. Então vou trabalhar com um tubo controle.
Vou então utilizar um tubo semeado de 0,1ml do caldo BHI no plasma sanguíneo, e um tubo controle que só vai ter o plasma sg.
Diferente das outras analises, esses 2 tubos não vou encubar em estufa, vou colocar em banho Maria 36ºC durante um tempo que vai variar de 6 a 18 horas.
Como estou fazendo a prova da coagulase, tenho como objetivo verificar a formação de coágulos no meu meio de cultura.
No momento que começar a formar meio de fibrina, grumos, significa que eu tenho produção da enzima coagulase. Então a prova seria positiva, porem eu preciso ver o meu tubo controle também.
O que vai acontecer: 
- Tubo semeado: com formação de coágulos 
- Tubo controle: normal sem alteração 
Significa que: os coágulos foram formados pela produção da enzima coagulase pelos MO que estão contaminando a minha amostra. Com isso, a minha amostra é Coagulase +;
Se eu tiver esse resultado positivo é mais uma chance de ser o s.aureus.
Se o meu tubo semeado ele apresentar formação de coágulos e meu tubo controle também, isso significa que provavelmente o meu plasma sanguíneo estava contaminado. Vou precisar repetir a minha analise. 
Se o meu tubo semeado e meu tubo controle não apresentarem alterações, significa que não é s.aureus. É negativo para a pesquisa da coagulase. (Coagulase -)
Sempre lembrar que eu preciso trabalhar com um par, ou seja, com um tubo semeado e um tubo controle, e pra ver o resultado eu preciso ver os 2 também.
Prova da DNAse
Prova da termonuclease
Essas 2 provas são baseadas na pesquisa de 2 toxinas (DNAse e Termonuclease). 
A termonuclease é uma enzima termorresistente que só é destruída em temperaturas acima de 100ºC. Então ela é uma toxina termoeresistente. Por essa característica que vai ser a toxina que vai ser produzida pelo s.aureus que vai estar mais envolvida em surtos.
Já a DNAse também vai estar envolvida em surtos, porem em menos quantidade quando comparada com a termonuclease porque a DNAse é termossensivel, sendo facilmente destruída pelo tratamento térmico.
Essas 2 toxinas são importantes porque são elas que promovem a intoxicação do individuo. 
Lembrar que o S. aureus é um MO do tipo intoxicação, com isso, significa o que vai provocar os sintomas é a ingestão da toxina, essa toxina vai ser sempre pré-formada no alimento e nunca no TGI.
Como vou fazer:
Utilizo uma placa de petri para cada uma dessas provas, sendo que o meio de cultura é o mesmo, que é o Azul de Toluidina.
Vou ter uma placa já com o meio de cultura pronto, é um Ágar, como se fosse um plaqueamento em superfície, onde a placa já está com o meio de cultura.
Vou pegar um bastão de vidro estéril e vou furar o meu meio de cultura fazendo vários buraquinhos. Tanto a placa da DNAse quanto na placa termonuclease.
Na placa de DNAse: vou gotejar gotas do meu BHI em cada buraquinho desses. Gotejei e guardo minha placa.
Vou fazer a termonuclease: o que vai ser diferente na analise da pesquisa de termonuclease para a pesquisa da DNAse: no caso da termonuclease vou pegar o meio BHI e vou aquecer durante 15 minutos. Porque a termonuclease é termorresistente, então aquecendo vou estar eliminando as toxinas que são termossensíveis e vou estar eliminando os MO.
Importante: A prova da termonuclease deve ser a última prova feita, porque o caldo BHI vou utilizar em todas as provas bioquímicas, se eu aquecer esse caldo BHI eu vou matar todos os meus MO e com isso não consigo usar essa amostra para as outras provas.
Depois que aquecer meu caldo BHI, vou pegar um pouco desse caldo BHI e vou gotejar nos buraquinhos na placa destinada à análise da termonuclease.
Já fiz inoculação nas 2 placas, agora vou encubar as 2 placas:
Vou incubar a 35-37ºc, durante 24-48 horas.
Após a incubação, se as enzimas estiverem presentes, o que vai acontecer (nas 2 placas):
As enzimas, tanto a DNAse quanto termonuclease vão reagir com o Azul de Toluidina que está presente no meio, e no momento que ocorre essa reação vai formar um halo róseo ao redor do buraco, e a formação do halo rosa ao redor dos buraquinhos isso significa a presença da toxina.
A formação do halo rosa vai ser característico da presença da toxina. 
Nesse momento, posso ter DNAse positiva, e a termonuclase negativa, vai depender do meu MO.
Mas para ser staphylococcus aureus, eu preciso que nas 2 placas tenha tido a formação do halo róseo. 
Agora eu posso afirmar que o que está contaminando o meu alimento é o s.aureus.
Ou seja, as colônias negras com halo claro que cresceram, são colônias de s.aureus.
Vimos características e depois como se faz a verificação e a contagem.