08_-_Fibra_em_detergente_neutro

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Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Rurais
Departamento de Tecnologia e Ciência dos Alimentos
Curso de Graduação em Agronomia
Disciplina de Bromatologia Animal
Protocolo de Protocolo de 
Fib DFib DFibra em Detergente Fibra em Detergente 
N t (FDN)N t (FDN)Neutro (FDN)Neutro (FDN)
Professor: Renius Mello
by Prof. Renius Mello
Van Soest vs. Weende
 
VAN SOEST 
Componentes da forragem 
WEENDE 
Nitrogenados Não-nitrogenadosg g
 Extrato 
 Proteína Gorduras etéreo 
CONTEÚDO CELULAR solúvel 
(solúvel em detergente Solúveis em água(solúvel em detergente Solúveis em água
neutro) Nitrogênio Amido Extrato não- 
 não-protéico Pectina nitrogenado 
 
S lú l P t í HEMICELULOSESolúvel Proteína HEMICELULOSE
 deterg. ácido insolúvel 
PAREDE CELULAR LIGNOCELULOSE Nitrogênio LIGNINA 
(Fibra em detergente (Fibra em detergente lignificado (Sol. em álcali)( b a e de e ge e ( b a e de e ge e g cado (So . e á ca )
neutro) ácido) 
 LIGNINA Fibra bruta 
 (Insolúvel) 
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 CELULOSE 
 
Van Soest e Moore (1966). 
by Prof. Renius Mello
1. Objetivo
‰ Determinar a fibra em detergente neutro (FDN) em alimentos
para animais.
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2. Método
‰ Determinação da FDN por refluxo (AOAC 2002.04)ç p ( )
‰ Goering & Van Soest (1970)
‰ Van Soest et al. (1991)
‰ Mertens (2002)‰ Mertens (2002)
‰ Determinação da FDN em sacos sob pressão‰ Determinação da FDN em sacos sob pressão
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3. Escopo
‰ Este método é aplicável para a determinação da fibrap p ç
em detergente neutro (FDN) em todos os tipos de
forragens e rações.forragens e rações.
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4. Princípio básico
‰ Uma solução detergente neutro é usada paraç g p
dissolver as pectinas e o conteúdo das células vegetais
(proteínas, açúcares e lipídeos), deixando um resíduo(proteínas, açúcares e lipídeos), deixando um resíduo
fibroso (FDNa) ou componentes da parede celular das
plantas (celulose hemicelulose e lignina)plantas (celulose, hemicelulose e lignina)
‰ O detergente é usado para solubilizar as proteínas e og p p
sulfito de sódio também ajuda na remoção de alguma
matéria nitrogenadag
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4. Princípio básico
‰ O EDTA é usado para quelatar o cálcio e remover as
pectinas em temperaturas de ebuliçãop p ç
‰ O tri-etilenoglicol ajuda a remover alguma matéria não
fibrosa de alimentos concentradosfibrosa de alimentos concentrados
‰ A amilase termo-estável é usada para remover amidop
‰ Duas adições de amilase (uma durante o refluxo e outra durante a
filtração) são usadas para auxiliar as análises de FDNa e minimizarfiltração) são usadas para auxiliar as análises de FDNa e minimizar
as dificuldades de filtragem.
‰ As amilases termos-estáveis são usadas em soluções quentes para‰ As amilases termos estáveis são usadas em soluções quentes para
inativar enzimas contaminantes potenciais que podem degradar os
constituintes fibrosos. 7
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5. Equipamentos
‰ Aparelho de refluxop
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5. Equipamentos
‰ Dispositivo de filtragem por sucção com válvula parap g p ç p
quebrar o vácuo
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5. Equipamentos
‰ Béqueres Berzelius (600 ml)q ( )
‰ Cadinhos de vidro poroso (Gooch), porosidade
grossa, 50 mL
‰ Balança analítica eletrônica com precisão de 0 1 mg‰ Balança analítica eletrônica com precisão de 0,1 mg
‰ Estufa de secagem por ar forçado a 100°C‰ Estufa de secagem por ar forçado a 100 C
‰ Dessecador e tenaz/pinçap ç
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6. Reagentes
‰ Solução detergente neutro (18 L):
‰ 17,82 L de água destilada
‰ 540 g de lauril sulfato de sódio (C12H25NaO4S)
‰ 335 g de EDTA (etilenodiaminotetracético) sal dissódico‰ 335 g de EDTA (etilenodiaminotetracético) sal dissódico
(C10H14N2O8Na2.2H2O)
d b tit i 72 d hid ó id d ódi (N OH) 263‰ pode-se substituir por 72 g de hidróxido de sódio (NaOH) e 263 g
de EDTA ácido (C10H16N2O8) como alternativa menos dispendiosa
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‰ 122,58 g de borato de sódio decahidratado
(Na2B4O7.10H2O), grau reagente
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6. Reagentes
‰ 82,08 g de fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO4),
grau reagente
‰ 180 mL de tri-etilenoglicol (C6H O ) grau reagente‰ 180 mL de tri etilenoglicol (C6H14O4), grau reagente
‰ Sulfito de sódio anidro (Na2SO3)( 2 3)
‰ Acetona ((CH3)2CO), grau reagente
‰ Solução de alfa-amilase termo-estável
‰ A3306 (Sigma) ou Termamyl (Novozymes)
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7. Precauções de segurança
‰ A acetona é altamente inflamável
‰ Os vapores não devem se acumular no local de trabalho.
Usar um dispositivo eficaz para remoção dos gasesUsar um dispositivo eficaz para remoção dos gases
emanados.
‰ Evitar a inalação ou contato com a pele.
‰ Certifique se de que todos os vestígios de acetona tenham‰ Certifique-se de que todos os vestígios de acetona tenham
evaporado dos cadinhos contendo os resíduos de fibra antes
de colocá los na estufa de secagemde colocá-los na estufa de secagem.
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7. Precauções de segurança
‰ O lauril sulfato de sódio é irritante para as mucosas.p
Usar máscara contra poeira e luvas durante o
manuseio.manuseio.
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8. 
Procedimento/marcha/roteiro
I. As amostras devem ser secas em estufa a 55±5°C até 85%
de matéria seca e moídas em peneira com crivos de 1 mm.
II Secar os cadinhos de vidro poroso de 50 mL a 100°C porII. Secar os cadinhos de vidro poroso de 50 mL a 100 C por
uma noite, esfriar em dessecador e pesar (P1), registrando o
peso com aproximação de 0 1 mgpeso com aproximação de 0,1 mg.
III. Misturar bem a amostra, pesar cerca de 0,45-0,55 g (P2) no
béquer e registrar o peso com precisão de 0,1 mg.
9 Pesar uma segunda sub-amostra para determinação da matéria secag p ç
laboratorial.
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8. 
Procedimento/marcha/roteiro
IV. Pré-aquecer o aparelho de extração por aquecimento
(refluxo) para uma temperatura que permita a ebulição da
solução detergente neutro dentro de 5 min.
V. Adicionar 0,5 g de sulfito de sódio utilizando um colher
previamente calibradapreviamente calibrada
VI. Adicionar 50 mL de solução detergente neutro e agitar o
béquer até que a amostra e o sulfito de sódio estejam
suspensos.
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8. 
Procedimento/marcha/roteiro
VII. Colocar o béquer na unidade de aquecimento sob o
condensador de água fria. As amostras devem ferver em 4 a 5
min. Normalmente as amostras espumam vigorosamente por 1-
2 min. Não reduzir a temperatura do digestor durante este
tempo.
VIII. Após 5 minutos, remover o béquer da unidade de refluxo e
adicionar 2 mL da solução de amilase padronizadaadicionar 2 mL da solução de amilase padronizada.
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8. 
Procedimento/marcha/roteiro
IX. Agitar o béquer para misturar a amilase na solução
detergente neutro e ressuspender as partículas. Retirar toda a
amostra aderida nas laterais ou no fundo do béquer usando um
bastão de borracha. Enxaguar o bastão com solução de FDNa.
X Retornar o béquer para a unidade de refluxo e permitir queX. Retornar o béquer para a unidade de refluxo e permitir que
alcance a fervura. Deixar em refluxo durante 60 min. Cinco a
10 minutos após a adição de amilase lavar as laterais do10 minutos após a adição de amilase, lavar as laterais do
béquer com solução detergente neutro.
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8. 
Procedimento/marcha/roteiro
XI. Remover a amostra da unidade de aquecimento e deixar
repousar por 30-60 segundos antes da filtragem.
XII Pré-aquecer o cadinho de vidro poroso antes da filtragemXII. Pré aquecer o cadinho de vidro poroso antes da filtragem
adicionando 40 mL de água fervente. Retirar a água com
vácuovácuo.
XIII. Virar
os primeiros 30-40 mL de solução do béquer no
cadinho. Lavar a borda do béquer para impedir que a solução
com partículas escorra para fora do béquer. Manter o béquer
na posição "virada" durante o esvaziamento. Retirar a solução
com o mínimo de vácuo. 19
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8. 
Procedimento/marcha/roteiro
XIV. Fechar o vácuo e lavar o resíduo remanescente do béquer
para o cadinho com água quente. Garantir que nenhuma
partícula permaneça no béquer. Aplicar o mínimo de vácuo
para filtrar.
XV Encher o cadinho com água quente até a metade eXV. Encher o cadinho com água quente até a metade e
adicionar 2 mL de solução de amilase padronizada. Deixar
reagir por aproximadamente 45 a 60 segundos enquanto oreagir por aproximadamente 45 a 60 segundos, enquanto o
bastão solta as partículas do béquer.
é áXVI. Lavar o béquer com água quente enquanto invertido sobre
o cadinho até que todos os resíduos sejam transferidos. 20
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8. 
Procedimento/marcha/roteiro
XVII. Filtrar e lavar duas vezes adicionando 30-40 mL de água
quente ao resíduo no cadinho de vidro poroso, permitindo que
fique de molho por 2 minutos em cada lavagem.
XVIII. Lavar a amostra duas vezes com 30 mL de acetona,
permitindo que fique de molho por pelo menos 2 minutos entrepermitindo que fique de molho por pelo menos 2 minutos entre
as lavagens.
XIX. Lavar o bastão, secar a amostra à vácuo, e retirar a
amostra do conjunto de filtragem.
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8. 
Procedimento/marcha/roteiro
XX. Secar os cadinhos à 100°C por 8 horas ou durante uma
noite, esfriar em dessecador, pesar, e registrar o peso (P3) com
aproximação de 0,1 mg.
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9. 
Comentários/Considerações
‰ A obstrução dos cadinhos de vidro poroso podeç p p
resultar em dificuldade de filtração.
O di h d li l t l ㉠Os cadinhos devem ser limpos regularmente com solução
de limpeza ácida ou alcalina
‰ A taxa de filtração dos cadinhos deve ser tão uniforme
quanto possível para um dado conjunto de amostrasq p p j
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9. 
Comentários/Considerações
‰ Para verificar a taxa de filtração dos cadinhos, enchê-los
com 50 mL de água destilada e registrar o tempo necessário
para drenar completamente sem vácuo. Deve ser ± 180 seg.
‰ Se a filtração levar mais de 240 segundos, os cadinhos precisam
de limpeza. Se a limpeza não melhorar a taxa de filtração, o cadinhop p ç
deve ser descartado.
‰ Se filtragem levar menos de 120 segundos, verificar se o cadinhoSe t age e a e os de 0 segu dos, e ca se o cad o
tem rachaduras ou furos no disco poroso.
‰ Se filtragem levar menos de 100 segundos o cadinho deve ser‰ Se filtragem levar menos de 100 segundos, o cadinho deve ser
descartado.
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9. 
Comentários/Considerações
‰ O vácuo adequado é crítico para uma boa filtragem.q p g
‰ Deve ser suficiente para remover as soluções rapidamente,
mas não tão grande que as partículas de fibra tampem omas não tão grande que as partículas de fibra tampem o
disco poroso.
‰ A água de lavagem deve estar acima de 95°C,
principalmente para as amostras que contenhamprincipalmente, para as amostras que contenham
substâncias pécticas, mucilagens ou glicoproteínas.
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9. 
Comentários/Considerações
‰ Alguns tipos de amostra são difíceis de filtrarg p
(silagem de milho, polpa cítrica, farelo de girassol,
subprodutos de carne e fezes)subprodutos de carne e fezes)
‰ A experiência tem mostrado que qualquer amostra que
l d f l á f l dleve mais de 10 min para filtrar irá fornecer resultados
errados e devem ser repetidos com as modificações descritas
(2002) S l ( 99 )por Mertens (2002) ou Van Soest et al. (1991)
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9. 
Comentários/Considerações
‰ Muitos extratos de amilase são misturas brutas queq
podem conter enzimas que degradam a fibra. Como o
calor inativa essas enzimas contaminantes, écalor inativa essas enzimas contaminantes, é
recomendável que a alfa amilase termo-estável seja
usada em solução quente para minimizar a perda deusada em solução quente para minimizar a perda de
fibras.
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10. Cálculos
‰ Dados:
Cadinho + FDN = 40,9394
Cadinho vazio = 40 6982Cadinho vazio = 40,6982
FDN = 0,2412
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10. Cálculos
‰ PI:
0,5000 g MPS 0,2412 g FDN
36 18 % MPS X36,18 % MPS X
X = 17,45% de FDN no PI
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10. Cálculos
‰ MS:
34,40 % MS 17,45 % FDN
100 00 % MS X100,00 % MS X
X = 50,73% de FDN na MS
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10. Cálculos
‰ Percentagem de FDNa em base seca:g
Onde:Onde:
P1 = peso da tara do cadinho em g
P2 = peso inicial da amostra expressa em gP2 = peso inicial da amostra, expressa em g
P3 = peso do cadinho mais resíduo/fibra secos, em g 31
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10. Cálculos
‰ Conteúdo celular (CC) no PI:( )
 
 
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10. Cálculos
‰ Conteúdo celular (CC) na MS:( )
 
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13. Controle de qualidade
‰ Incluir uma ou mais amostras como controle de qualidade
(QC) em cada corrida. Incluir pelo menos uma duplicata em
cada corrida se determinações únicas estão sendo feitas.
‰ O desvio padrão médio aceitável entre as análises de
replicatas para FDNa varia de ± 0 35 para amostras com 40%replicatas para FDNa varia de ± 0,35 para amostras com 40%
FDN a ± 0,60 para amostras com 70% FDN, resultando em
limite de alerta (2s) variando de ±0 70 a 1 20 e um limite delimite de alerta (2s) variando de ±0,70 a 1,20, e um limite de
controle (3s) variando de ±1,05 a 1,80.
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13. Controle de qualidade
‰ Plotar os resultados da amostra(s) QC em um gráfico( ) Q g
e examinar as tendências:
R lt d f d i t l d fi d 95% ( 2 ) id i‰ Resultados fora do intervalo de confiança de 95% (±2s) evidenciam
possíveis problemas com o sistema analítico.
‰ Resultados fora dos limites de confiança de 99% (±3s) indicam perda
de controle, e os resultados da corrida devem ser descartados.
‰ A queda de duas análises consecutivas em um lado da média entre
os limites de alerta e de controle também indicam perda de controle.
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Dúvidas?
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Foto: A-200/A220 (Ankom) Foto: A-2000 (Ankom)