Nutrigenômica

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

Introdução
Transcriptômica via SuperSAGETranscriptômica via SuperSAGE
Prof. Éderson Kido
Depto Genética
08/2013
Objetivos
• Apresentar o método SuperSAGE de
transcriptômica
• Destacar o potencial para identificar genes
diferencialmente expressos, com potencial
biotecnológico ou de saúde.
SuperSAGE: uma visão
Qualitativa e Quantitativa
EcoP15
AAAAAAA-3‘
TTTTTTT-5‘cDNA
AAAAAAA-3‘
TTTTTTT-5‘cDNA
Tag Tag Tag Tag ----contagemcontagemcontagemcontagem
TTTTTTT-5‘
AAAAAAA-3‘
TTTTTTT-5‘
cDNA
AAAAAAA-3‘
TTTTTTT-5‘cDNA
SuperTags
.
.
.
.
.
.
AnotaçãoAnotaçãoAnotaçãoAnotação
SAGE
Serial Analysis of Gene Expression
(Velculescu et al., 1995)
4
6
1
Concatenação de 
Formação de ditags
Anotação limitada:
• A tag (pequena = 14 pb) é observada em vários genes
• O jeito seria gerar tags maiores
Contagens 
de tags
Poli(A)+ mRNA Extração de tags (14bp)
Concatenação de 
ditags / clonagem
BsmFI (15 pb para SAGE)
GGGACNNNNNNNNNN^
CCCTGNNNNNNNNNNNNNN^- 5’
O tamanho da tag
depende da Enzima
CCCTGNNNNNNNNNNNNNN^- 5’
TCCRACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN^
AGGYTGNNNNNNNNNNNNNNNNNN^-5’
CAGCAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN^
GTCGTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN^- 5’
EcoP15I (26 pb para SuperSAGE)
MmeI (20 pb para LongSAGE)
Vantagens da SuperSAGE (26 pb)
(Matsumura et al., 2003)
� Melhor identificação tag-gene
� Melhor perfil de transcrição (até dois eucariotos� Melhor perfil de transcrição (até dois eucariotos
em mesma amostra)
� Permite usar astags como primers em PCRs
� Usar as tags como sondas em chips de DNA;
� Usar as tags em silenciamento gênico (RNAi)
18-20bp (MmeI, LongSAGE)
Comparar 20 bp versus 26 bp
Vantagem das 26 pb
Diferenciar transcritos
CATGGTGGCTCACAACCATC
CATGGTGGCTCACAACCATC
CATGGTGGCTCACAACCATC
CATGGTGGCTCACAACCATC
26 bp (EcoP15I, SuperTAG)
Immunoglobbulin kappa chain
Tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10
Homeodomain leucine zipper-encoding gene
Mannose phosphate isomerase 1, transcript variant 4
CATAAC
CGTAAT
TGTAGA
TGTATC
BLAST hit, Mus musculus, Score= 52
Experimento ...
• Experimento: 
Contrastantes: Tratamentos vs Controle
• Extrair RNA total;
• Purificar transcritos Poli A+
• Gerar bibliotecas;
• Sequenciar tags;
mRNA para cDNAs...
AAAAAAAAAAAA
mRNA
cDNA
5‘ 3‘
Transcriptase Reversa
SuperScript III
cDNA dupla fita
Amplificação
cDNA
5‘3‘
5‘ 3‘
5‘3‘
DNA polimerase I
*****GACGACTTTTT
Eco P15 I 
Oligo dT-Primer 
*****GACGACTTTTT
cDNAs
Digestão com NlaIII
Biotina
5‘ 3‘
5‘3‘ *****GACGACTTTTT
AAAACTGCTG*****
TTTTGACGAC*****
Captura magnética (Streptavidina e Beads) 
Ligação de Adaptador ao cDNA
CAGCAGCATG
GTCGTCGTAC
AAACTGCTG****
TTTGACGAC**** BM
Linker 1E
Biotina
Biotina
CATG
CATG
SuperSAGE: enzima EcoP15I
Dois sítios de reconhecimento 
inversamente orientados 
(head to head)
5’
5’3’
3’
27 pb distante
Sítio de corte
CAGCAG CTGCTG
GACGACGTCGTC
N
N
N
N
25 pb
Geração da tag
Digestão c/ Eco P15 I
BM
CAGCAGCATG
GTCGTCGTAC
AAACTGCTG****
TTTGACGAC****Linker 1E
27 pb
Biotina
sequenciamento / Extração da tag
Purificação do Linker-Tag
Ligação de um segundo adaptador
CAGCAGCATG
GTCGTCGTACLinker 1E
Linker 2E**
Análise estatística dastags
• Software DiscoverySpace 4.0 
– Arquivos com frequências das tags
– Exclusão das tags singlets
– Teste de p-value (Audic-Claverie; p < 0,05)
– tags diferencialmente expressas 
(classificadas em induzidas ou reprimidas ) 
Bioinformática das tags
• Anotação de tags (BlastN) contra bancos de ESTs
(NCBI, outros)
• ESTs não anotadas (mas com tags) são categorizadas• ESTs não anotadas (mas com tags) são categorizadas
via ontologia gênica (termos hierárquicos)
• Anotação + termos GO permitem buscas com palavras-
chave
• Dados de regulação (indução e repressão) geram perfis
de expressão.
Fluxograma de Análises
Exemplo de alinhamento BLASTn 
de tag com EST
Anotações e valores FC geram perfis de expressão
p/ genes de interesse (Ex: Fatores de Transcrição)
UR: unitags induzidas; FC: qtas vezes mais ou menos expressas 
comparando-se as bibliotecas
Perfis de expressão para Quinases (prots 
relacionadas com sinalização de estímulos)
Esquerda: controle; direita: tratamento; qto mais vermelho mais induzido 
Consideração Final
• A técnica facilita identificar genes
diferencialmente expressos em resposta a um
tratamento e em relação a um controle, a partir detratamento e em relação a um controle, a partir de
diferentes perfis de transcrição dos
transcriptomas.
• Alvos escolhidos são validados para estudos
futuros (desenvolvimento de marcador molecular,
transgenia, etc).