A clonagem posicional

UFMT

Enviado por Raissa Bernacz em 15/11/2013

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Monograﬁas SBG
A clonagem posicional – uma abordagem para
o estudo do genoma funcional
Ana Lúcia Brunialti Godard
© 2008, dos autores
Direitos reservados desta edição
Sociedade Brasileira de Genética
Diagramação, revisão, capa e projeto gráfico
cubo multimidia
Editora SBG
Sociedade Brasileira de Genética
Ribeirão Preto, SP
Godard, Ana Lúcia Brunialti
A clonagem posicional - uma abordagem para
o estudo do genoma funcional. / Ana Lúcia Brunialti
Godard - Ribeirão Preto: SBG, 2008.
151p.
ISBN - 978-85-89265-04-1
I. Autor. II. Título.
Sumário
INTRODUÇÃO ............................................................................................ 11
A análise da função gênica através da estratégia “ descendente” ................ 12
A análise da função gênica pela estratégia “ascendente” ........................... 13
MODELO ANIMAL ..................................................................................... 14
Vantagens de se utilizar o camundongo como modelo animal .................. 15
O genoma murino..................................................................................... 17
Para onde vamos agora? ............................................................................ 20
A MUTAÇÃO PROGRESSIVE MOTOR NEURONOPATHY (pmn) ................. 24
Descrição clínica ...................................................................................... 24
Dados anatomopatológicos ....................................................................... 24
Músculos e nervos periféricos .............................................................. 24
Medula Espinal .................................................................................... 25
O PRINCÍPIO GERAL DA CLONAGEM POSICIONAL .................................. 28
O mapeamento genético ........................................................................... 30
O mapeamento da mutação sobre um cromossomo particular............. 30
A construção de um mapa genético de alta densidade e de alta resolução
ao redor do gene mutado .................................................................... 31
Microssatélites X SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) .................. 38
O mapeamento físico ................................................................................ 39
A eletroforese em campo pulsado ........................................................ 40
Os PAC, YAC e BAC ............................................................................ 41
Salto e caminhada sobre o cromossomo: chromosome jumping e chromoso-
me walking .......................................................................................... 42
Isolamento das seqüências codiﬁcadoras .................................................. 43
Conservação ao longo da evolução: Zooblots ......................................44
A análise de Northern blot ...................................................................44
A ampliﬁcação de éxons ou Exon trapping ........................................... 45
A captura do DNA por afinidade ou DNA affinity capture ou DNA
selection .............................................................................. 45
A sondagem de biblioteca de cDNA ....................................................46
Os métodos baseados na análise das ilhas CpG ................................... 47
O sequenciamento genômico .............................................................. 49
As outras técnicas ................................................................................ 49
A identiﬁcação direta do cDNA candidato ................................................ 50
Isolamento de um mensageiro completo ................................................... 51
A identiﬁcação do bom candidato ............................................................ 52
A clonagem posicional nos tempos atuais ................................................. 53
ESTUDO DE CASO ...................................................................................... 56
Mapeamento genético do lócus pmn ........................................................ 56
Localização cromossômica da mutação pmn (BRUNIALTI et al., 1995) 56
Mapa genético humano .......................................................................58
Construção de um contig contendo o lócus pmn ......................................58
Isolamento e caracterização preliminar dos YAC que contêm D13Mit215,
D13Mit305, D13Mit115, Gli11 e Gli20 ................................................. 59
Isolamento e caracterização preliminar dos BAC contendo os marcadores
D13Mit215, Gli11, Gli20 e D13Mit115 .................................................. 60
Mapa físico ao redor do lócus pmn ........................................................... 61
Isolamento e caracterização dos éxons a partir do DNA do contig ............ 63
As EST ......................................................................................................64
A MUTAÇÃO pmn: UM MODELO DE NEUROPATIAHUMANA ..................66
pmn: um modelo potencial para a patologia neuromuscular humana ........66
pmn: uma mutação de efeitos independentes ......................................66
pmn não é o lócus homólogo ao lócus responsável pela amiotroﬁa espinal
do tipo Werdnig Hoffmann humana ....................................................66
pmn: um bom modelo análogo às amiotroﬁas espinais ............................. 67
pmn, onde está o mal? .........................................................................68
A etapa seguinte ....................................................................................... 69
Podemos deﬁnir o perﬁl de um gene candidato? ....................................... 70
FINAL DA HISTÓRIA ....................................................................................72
MATERIAL E MÉTODOS UTILIZADOS NO ESTUDO DA MUTAÇÃO pmn ..73
Origem dos alelos mutantes e das linhagens utilizadas ..............................73
Protocolos experimentais utilizados no estabelecimento do mapa genético .....74
Cruzamentos realizados ....................................................................... 74
Extração do DNA ................................................................................ 74
Reação em cadeia da polimerase (PCR) ............................................... 75
Iniciadores .................................................................................... 75
Condições de ampliﬁcação ........................................................... 75
Análise dos produtos de PCR ......................................................... 76
Análise do polimorﬁsmo dos microssatélites pela SSCP ................. 76
Análise dos resultados ...................................................................77
A coleção de DNA do EUCIB ...................................................................77
Protocolos experimentais utilizados no estabelecimento do mapa físico ....77
Preparação do DNA de levedura em blocos de agarose (adaptado de
BIRREN at al., 1993) ....................................................................77
Eletroferese e campo pulsado e hibridização........................................ 78
Isolamento das extremidades dos cromossomos artiﬁciais de levedura pela
PCR-inversa (adaptado de ARVEILER; PORTEUS, 1991) ........................ 79
Mapa de restrição do contig de YAC .................................................... 80
Preparação do DNA genômico a partir do BAC ................................... 81
Isolamento e caracterização das seqüências codiﬁcadoras ........................ 82
RT-PCR ................................................................................................ 82
Ampliﬁcação
dos éxons ...................................................................... 83
O vetor pSPL3 ............................................................................... 83
Transfecção das células COS-7 ...................................................... 84
Isolamento do RNA citoplasmático ................................................ 84
Ampliﬁcação e clonagem dos éxons capturados ............................ 84
Sequenciamento ....................................................................................... 86
Métodos .............................................................................................. 86
Análise das seqüências ........................................................................ 86
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 87
ANEXO I- FIGURAS ................................................................................... 107
ANEXO II- TABELAS ................................................................................... 148
Lista de Figuras
Figura 1: As estratégias da clonagem ........................................................... 107
Figura 2: Mutação alcaptonúria (aku). ......................................................... 108
Figura 3: Animal modelo da fenilcetonúria (PKU) humana. ......................... 109
Figura 4: Relações evolutivas entre os modelos mais utilizados em laboratório. ..110
Figura 5: Oxford Grid. ..................................................................................111
Figura 6: A mutação pmn ............................................................................112
Figura 7: Cortes histológicos. ........................................................................113
Figura 8: Nervo frênico. ..............................................................................114
Figura 9: Fenótipo obeso. ............................................................................115
Figura 10: Principio da clonagem posicional. ................................................116
Figura 11: Tipos de cruzamentos utilizados nos projetos de mapeamento. ....117
Figura 12: Estratégias do mapeamento. ........................................................118
Figura 13: Árvore filogenética da ordem muridae. ........................................119
Figura 14: Ilustração do principio de RFLP (Polimorfismo de Comprimento de
Fragmentos de Restrição. .......................................................................... 120
Figura 15: Meios microssatélites e sua detecção. ...........................................121
Figura 16: SSCP - Alelos e sua detecção. .................................................... 122
Figura 17: Mapa comparativo das regiões de ortologia entre o cromossomo 13 murino
(à direita) e os segmentos cromossômicos 1, 3, 5, 6, 7, 9 e 10 humanos. ............123
Figura 18: Princípio da clonagem em YAC. ...................................................124
Figura 19: Construção do vetor BAC. .......................................................... 125
Figura 20: Ilustração da técnica do salto no cromossomo. ............................126
Figura 21: A marcha sobre o cromossomo. ...................................................127
Figura 22: Princípio da amplificação dos éxons internos ou Éxon-Trapping. ...128
Figura 23: Captura de cDNA por afinidade ................................................. 130
Figura 24: Principio da RACE. ......................................................................131
Figura 25: Identificação da mutação. ..........................................................132
Figura 26: Haplótipo. .................................................................................. 134
Figura 27: Cruzamento intra-especifico. ........................................................135
Figura 28: Mutação “Extra-toe” e o estoque balanceado. ............................ 136
Figura 29: Localização precisa dos marcadores microssatélites no cromossomo 13
murino. ........................................................................................................137
Figura 30: Mapa genético parcal da região cromossômica de interesse. ....... 138
Figura 31: Análise pela eletroforese em campo pulsado dos YAC Y902.2, Y903.1 e
Y13.115. ...................................................................................................... 139
Figura 32: Organização dos YAC. ................................................................ 140
Figura 33: Análise por Southern blot da extremidade esquerda do clone Y902.2. .... 141
Figura 34: Mapa de restrição do contig de YAC que cobre a região pmn. .... 142
Figura 35: Localização dos éxons e das ESTs. ............................................... 143
Figura 36: Análise pela PCR das EST humanas E7 (A006127) e E2 (WL9635). ... 144
Figura 37: Isolamento das extremidades do YAC através da PCR inversa. ..... 145
Figura 38: Principio da amplificação dos éxons internos ou Éxon-Trapping. .. 146
Figura 39: O vetor de expressão pSPL3. .......................................................147
Lista de Tabelas
Tabela 1...................................................................................................... 148
Tabela 2...................................................................................................... 149
Tabela 3...................................................................................................... 149
Tabela 4...................................................................................................... 150
Tabela 5...................................................................................................... 150
Tabela 6...................................................................................................... 150
Tabela 7...................................................................................................... 150
Tabela 8.......................................................................................................151
APRESENTAÇÃO
Tese de Doutorado apresentada no Programa
de Pós-Graduação em Genética Humana da
Universidade Pierre e Marie Curie – Paris VI –
França, sob a orientação do Dr. Jean-Louis
Guénet.
11
INTRODUÇÃO
Para que um dia se possa conhecer a função da totalidade
dos genes que compõem o genoma humano e dos mamíferos, os
geneticistas modernos possuem, de forma geral, duas estratégias
(Figura 1).
A primeira, a qual podemos chamar de estratégia •
“descendente”, consiste em recuperar as seqüências codiﬁcadoras
de um gene, seja pelo seqüenciamento direto do DNA, seja
pelas seqüências codiﬁcadoras do produto de transcrição. Em
seguida, uma vez identiﬁcadas, tais seqüências são modiﬁcadas
de maneira a inativar a função do gene correspondente. Essa
estratégia consiste na indução de uma mutação, que, em geral,
acarreta o aparecimento de um alelo nulo não-funcional de uma
seqüência codiﬁcadora desconhecida e, por meio do estudo dos
efeitos provocados por essa mutação, poderemos compreender,
enﬁm, a função desse gene.
A segunda estratégia, dita “ascendente”, consiste, ao •
contrário da primeira, em analisarem-se as conseqüências de
uma alteração que apareceu de forma espontânea para podermos
chegar ao gene responsável. Essa estratégia também é chamada
de “genética inversa” ou “clonagem posicional”. Ela possibilita
um estudo aprofundado de uma mutação qualquer, visto que
podemos obter sua localização genética, e, como trabalhamos
com um fenótipo anormal, podemos efetuar análises detalhadas
sobre vários aspectos que nos conduzem ao gene responsável.
Justiﬁca tal estratégia a possibilidade de se obter um animal de
laboratório com uma mutação que apresente fortes semelhanças
aos de uma doença humana
geneticamente determinada.
Esse animal passa, então, a ser considerado um modelo dessa
síndrome humana e, com o estudo dele, poderemos adquirir
rapidamente informações preciosas e transponíveis ao homem.
Essas duas estratégias são teoricamente opostas, mas,
como veremos mais adiante, elas acabam se complementando.
12
Introdução
A análise da função gênica através da estratégia
“ descendente”
O seqüenciamento sistemático do genoma, o qual já
foi realizado para vários microorganismos, culminando com o
genoma humano em 2001 (VENTER et al., 2001; LANDER et
al., 2001) e com o dos camundongos em 2002 (WATERSTON
et al., 2002), representa um empreendimento facilmente
automatizável e apresenta a vantagem de nos levar diretamente
ao conhecimento profundo e íntimo da estrutura genômica do
organismo estudado. Infelizmente, essa estratégia é extremamente
cara para um organismo de grande complexidade como o
homem, por exemplo, no qual a proporção de seqüências
codiﬁcadores é inﬁnitamente minoritária em relação às demais.
A construção de bibliotecas de cDNA a partir de
moléculas de RNA mensageiro transcritas num tecido ou órgão
em particular representa uma vantagem considerável em relação
ao seqüenciamento direto, mas ela não permite a identiﬁcação
de todos os genes. Nós sabemos que, em média, 20% dos
genes transcritos num dado tecido aparecem na forma de
mRNA em populações minoritárias e, portanto, de difícil acesso.
Sabemos, igualmente, que vários genes são transcritos durante
um período de tempo muito curto e que o isolamento desses
genes numa biblioteca de cDNA é completamente aleatório.
Enﬁm, não podemos nos esquecer dos genes constitutivos
(ou genes de manutenção), transcritos o tempo todo, os quais
acabam atrapalhando o isolamento dos outros genes. Porém,
mesmo com todos esses inconvenientes, vários programas
para a identiﬁcação e o seqüenciamento destas seqüências
codiﬁcadoras foram lançados e nós observamos que, desde
1997, mais de 16.500 EST (Expressed Sequence Tag) foram
localizadas no genoma humano e, entre elas, apenas 2.600 já
eram conhecidas.
Uma vez identiﬁcadas essas seqüências transcritas, podem
elas ser mapeadas, servindo de marcadores moleculares, a ﬁm
de se densiﬁcar um mapa genético, e, enﬁm, no isolamento do
13
Introdução
cDNA completo. A partir deste, as vias estão abertas a todas as
manipulações para se conhecer a função do gene por meio da
sua invalidação.
A análise da função gênica pela estratégia “ascendente”
Como já foi mencionado anteriormente, essa estratégia
consiste na identiﬁcação de genes a partir de mutações
espontâneas ou induzidas que são identiﬁcadas por seus efeitos
fenotípicos. Essa estratégia, a qual também podemos chamar
de “genética inversa” ou de “clonagem posicional”, demanda
um grande número de cruzamentos envolvendo os animais
portadores das mutações para os estudos. Primeiramente,
começamos com o estudo de ligação ou mapeamento genético
da patologia de alta densidade e precisão; em seguida,
estabelecemos um mapa físico da região mapeada. Tal estratégia
só permite a identiﬁcação de um número minoritário de genes
que, quando mutados, levam ao aparecimento de um fenótipo
facilmente observado ab útero. Em compensação, ela oferece a
vantagem de partir de um fenótipo que pode ser analisado sob
vários aspectos – anatômico, histológico, ﬁsiológico, molecular,
etc –, para podermos chegar ao gene responsável.
Essa estratégia é particularmente justiﬁcada quando
possuímos uma mutação observada no animal de laboratório,
na qual os efeitos patológicos apresentam analogias com
aqueles observados numa doença genética humana, pois, nesse
caso, o animal é considerado um modelo potencial para a
patologia humana. O estudo e a clonagem do gene no animal,
sendo mais rápidos, nos permitiriam, então conhecer facilmente
o gene responsável pela doença no homem (exemplos nas
Tabelas 1 e 2).
14
MODELO ANIMAL
Como foi citado anteriormente, a estratégia da clonagem
posicional é particularmente interessante quando temos um
modelo animal de uma patologia humana. Entretanto, antes de
considerarmos um organismo como um “modelo”, devemos
saber o que é exatamente um “animal modelo”.
Modelos animais são preparações experimentais
desenvolvidas em determinada espécie com o propósito de
se estudarem fenômenos que ocorrem em uma outra espécie
(MCKINNEY, 1984). Estes são válidos se apresentarem as
mesmas estruturas envolvidas no comportamento ou na
patologia humana em estudo (KAPLAN, 1973). Geralmente,
os modelos animais aparecem como resultado de mutações,
espontâneas ou induzidas, que levam a uma alteração fenotípica
em decorrência de um produto protéico não-funcional ou
ausente. Uma grande coleção de mutações foi obtida ao longo
da história da genética de camundongos, cobrindo alterações
em quase todas as classes fenotípicas. Entre elas, podemos citar
mutações produzindo obesidade, malformações no sistema
auditivo, perda de pêlos e mudança de sua estrutura, nanismo,
anemia, desordens metabólicas e imunológicas com níveis de
severidade variáveis, entre outras (GODARD; GUÉNET, 1999).
Uma grande quantidade desses mutantes apresenta fenótipos
que se assemelham fortemente àqueles observados em certas
doenças humanas, podendo essas homologias se estender ao
nível molecular (GODARD; GUÉNET, 1999). A importância
desses modelos reside na possibilidade de se proporcionar
uma melhor compreensão das patologias humanas, servindo
como ferramentas para se tentar elucidar as vias bioquímicas
e ﬁsiológicas envolvidas nas doenças e possibilitando uma
identiﬁcação de alvos que permitam o desenvolvimento de
drogas terapêuticas (MOORE, 1999).
Muitos modelos já foram obtidos em vários laboratórios.
Entre eles, podemos citar a descoberta do modelo murino,
que apresenta características fenotípicas bastante semelhantes
15
Modelo Animal
às da alcaptonúria humana (Figura 2), o que permitiu o
mapeamento da mutação homóloga (simbolizada por aku) no
cromossomo 16 de camundongo e, por ortologia, a localização
marcadores humanos no cromossomo 3 ligados ao gene do
ácido homogentísico oxidase. Um segundo modelo é aquele
que apresenta uma distroﬁa muscular ligada ao cromossomo X
decorrente de uma mutação espontânea no gene mdx, levando
os animais a apresentar níveis elevados de creatina cinase e
piruvato cinase no plasma. O lócus mdx se mostrou homólogo
ao gene que codiﬁca a distroﬁna. No homem, mutações nesse
gene podem levar à Distroﬁa Muscular de Duchenne ou Becker.
Esses mutantes foram de extrema importância porque permitiram
a demonstração de que a falta de distroﬁna não era a principal
causa da doença humana. Outro exemplo é o modelo que
apresenta a Síndrome da Hiperfenilalaninemia (HPH) (Figura 3)
associada com a mutação hph1, que leva a uma ausência de
guanosina trifosfato ciclohidrolase (GTP-CH). Esse mutante é
considerado o modelo da fenilcetonúria humana (PKU). Vários
alelos deletérios no lócus da fenilalanina hidroxilase (Pah)
responsáveis por levar a síndromes com diferentes níveis de
gravidade foram isolados em camundongos. Estes possibilitaram
pela primeira vez uma explicação molecular para o fenômeno
de expressividade variável na fenilcetonúria humana. O mutante
Clock, isolado por Vitaterna em 1994, permitiu um estudo inicial
sobre um ritmo circadiano especíﬁco envolvido na atividade
locomotora, resultando no isolamento do gene candidato Clock,
por clonagem posicional.
Vantagens de se utilizar o camundongo como modelo
animal
Entre todos os organismos modelos conhecidos
atualmente, o camundongo é o escolhido por apresentar várias
características peculiares que o colocam à frente em relação
a outros modelos animais. A primeira dessas características
diz respeito ao fato de o camundongo possuir
um tempo de
geração curto (um ﬁlhote recém-nascido pode se tornar um
adulto em idade reprodutiva em 11 semanas) e é bastante
16
Modelo Animal
prolíﬁco. As fêmeas podem carregar muitos embriões por
gestação, e a possível morte de algum deles não compromete
o desenvolvimento dos outros e não põe ﬁm à gravidez. Em
laboratório, é fácil a manipulação e criação dessa espécie,
além de ser possível à realização de cruzamentos controlados
com o intuito de promover endogamia como, por exemplo,
cruzamentos do tipo irmãos versus irmãs. Isso leva, ao longo
das gerações, ao aparecimento de populações extremamente
homogêneas do ponto de vista genético, isto é, os animais são
como clones e são virtualmente homozigotos para todos os loci,
caracterizando as linhagens isogênicas (GUÉNET, 1998).
Como mencionado por Silver (1995), o período de
divergência evolutiva entre o homem e o camundongo, há
cerca de 60 milhões de anos, é o mais recente em relação aos
outros modelos animais disponíveis, como Xenopus, Drosophila
melanogaster e C. elegans (Figura 4). Assim, a enorme homologia
existente tanto no nível genotípico quanto no fenotípico
(ﬁsiologia, patologia, vias metabólicas) entre as duas espécies
justiﬁca fortemente a escolha desta em relação às outras para
o isolamento de modelos. O DNA codiﬁcador do camundongo
possui uma homologia em relação ao do humano que pode
variar de 70 a 90% (STRACHAN; REED, 2002), maximizando
as chances de se encontrarem genes ortólogos (mesmo gene
em diferentes espécies) nas duas espécies. A relação entre os
loci ortólogos do camundongo e os do homem pode ser mais
bem visualizada pelo Oxford Grid (Figura 5), desenvolvido
inicialmente por John Edwards em 1991 (LYON, 2002) e que é
atualizado diariamente. Em consulta realizada no MGI em 04
de agosto de 2003, mais de 9.800 regiões de homologia entre
o camundongo e o homem estavam disponíveis no banco de
dados. E esse número continua crescendo.
Depois do homem, o camundongo é o mamífero que
possui o genoma mais bem estudado e conhecido, devido à
grande quantidade de marcadores genéticos e de mutações
já isoladas e da possibilidade de se obterem proles viáveis e
férteis a partir de cruzamentos interespecíﬁcos, permitindo a
17
Modelo Animal
observação da segregação de polimorﬁsmos de várias classes
(GUÉNET, 1998).
O genoma murino
Em 2002 foi publicado o sequenciamento completo
do genoma de camundongos (WATERSTON et al., 2002). A
comparação dos mapas genético das duas espécies indica que
mais de 90% dos dois genomas podem ser posicionados em
regiões conservadas de sintenia, nas quais a ordem dos genes foi
conservada em ambas as espécies. Já ao nível do nucleotídeo,
aproximadamente 40% do genoma humano pode ser alinhado
ao genoma do camundongo.
Um esboço da seqüência genômica do camundongo,
representando 96% do genoma da eucromatina já está
disponível (Tabela 3). Através da análise destas seqüências
podemos constatar que os genes, como esperado dos estudos
precedentes, representam somente uma parcela pequena dos
genomas de mamíferos. No camundongo, o número de genes
codiﬁcadores de proteínas foi estimado entre 30.000 à 40.000,
mesmo número que no homem. A análise da seqüência indica
que há uma correlação positiva entre a densidade de genes e
o conteúdo (G+C), com 75-80% dos genes que residem nas
regiões do genoma ricas em (G+C). O catálogo dos genes
murino contém 29.201 transcritos preditos que correspondem
a 22.011 genes que contêm aproximadamente 213.562 éxons
distintos. Muitos genes detectados no genoma do camundongo
são novos e não foram identiﬁcados previamente. Há também
9.785 transcritos preditos que não correspondem a cDNAs
conhecidos.
Aproximadamente 99% de genes do camundongo têm
um homólogo no genoma humano e para 80% destes genes,
a correspondência no genoma humano encontra-se em um
intervalo conservado de sintenia. Isto indica que os genes
ortólogos provavelmente descendem de um gene ancestral
comum. Não existe gene predito ortólogo humano em menos
18
Modelo Animal
de 1% (118 genes) dos genes preditos no camundongo. Alguns
destes genes foram perdidos simplesmente porque foram
deletados em um genoma ou no outro. Também é possível que
as evidências nas quais as predições dos genes foram baseadas
estejam incorretas.
Os genomas dos mamíferos também codiﬁcam muitos
RNAs que não são traduzidos em proteínas. Estes incluem
RNAs envolvidos no processamento do mRNA e na tradução
(rRNAs e tRNAs). Recentemente foi descoberto RNAs envolvidos
no regulamento da expressão gênica e em outras funções (tais
como micro RNAs) e muitos novos RNAs cujas identiﬁcações
computacionais são difíceis.
Aproximadamente 37% do genoma do camundongo
(comparado a 46% do genoma humano) consiste em repetições
intercalares resultante das inserções de elementos de transposição
(transpósons) e estes talvez sejam a principal causa da diferença
no tamanho dos dois genomas (2,5 Gbp para o camundongo
contra 2,9 Gbp para o homem). Entretanto, o camundongo
tem as mesmas quatro classes de elementos de transposição
que o homem: i) elemento nuclear intercalar longo (LINE); ii)
elemento intercalar nuclear curto (SINE); iii) retrotranspóson
viral com repetições terminais longas (LTRs); e iv) transposóns
de DNA.
Como na maioria das espécies de mamíferos, o genoma
do camundongo também possuí seqüência de repetições simples
(SSRs), consistindo em curtas repetições em tandem perfeitas ou
quase perfeitas. Estes SSRs têm sido particularmente importantes
na geração de marcadores genéticos utilizados nos estudos de
ligação, pois oferecem um polimorﬁsmo de cumprimento e são
facilmente ampliﬁcados pela PCR. Neste sentido, o camundongo
parece representar uma exceção dentre os mamíferos, pois
tem 2/3 mais SSRs que o homem. Entre estes SSR, os seis di
-, tri- e tetrâmeros (AG, AAG, AGG, AAAG, AAGG, AGGG),
cópias com ao menos 20 bp são dez vezes mais comuns no
camundongo do que no genoma humano. Além disso, nas
19
Modelo Animal
SSRs que possuem numa ﬁta um intervalo rico em purina e na
outra ﬁta um intervalo rico em pirimidina é muito mais comum
e extenso no camundongo do que no homem.
Os polimorﬁsmos de nucleotídeos únicos (SNPs) também
são comuns no camundongo ao longo das diferentes linhagens
e estes SNPs são observados tanto nas regiões codiﬁcadoras
como fora delas. A densidade média de SNPs entre a linhagem
C57BL/6 e a linhagem BALB/c ou C3H/He está na escala 1 a
cada 500-700 pares de bases, porém a distribuição de SNPs
não é uniforme nas linhagens de laboratório. Nestas podemos
observar regiões ricas em SNPs (40 SNPs para 10 Kb) enquanto
outras extremamente pobres em SNPs (0,5 SNP para 10 KB).
80% de proteínas do camundongo parecem ter ortólogos
estritos de 1:1 no genoma humano. O restante pertence às
famílias dos genes que foram submetidos à expansão diferencial
em um dos dois genomas. Como exemplo dessa expansão,
podemos citar a família dos genes dos receptores de olfato,
onde as diferenças no número e na seqüência podem explicar
os diferentes graus de detecção dos odores existentes entre os
camundongos e os seres humanos. Um outro exemplo, é a
família do gene do citocromo P450, envolvida no metabolismo
de compostos xenobióticos. No geral, as famílias de genes são
signiﬁcativamente mais expandidas no camundongo do que no
homem.
As comparações de 95 regiões reguladoras bem
conhecidas no genoma do camundongo permitiu estabelecer
que a distribuição desses elementos era: 10% nos íntrons, 85%
na vizinhança imediata (< 2 kb) dos promotores e 5% mais
distais dos promotores. Aproximadamente 19% sobrepõem-se
a uma ilha CpG. A extensão da conservação destas regiões é
consideravelmente mais baixa do que em regiões codiﬁcadoras,
mas ainda muito mais alta do que a taxa média através do genoma.
Nestas regiões, o conteúdo (G+C) também é substancialmente
mais elevado do que para o genoma como um todo.
20
Modelo Animal
O sequenciamento de outras linhagens de camundongos,
que são comumente utilizadas pelas pesquisadores, também
será realizado em breve, bem como a anotação progressiva
desses genomas. Estas etapas são de extrema importância e, sem
dúvida alguma, nos ajudará na análise das doenças complexas
ou aqueles determinadas por vários genes (QTLs).
Para onde vamos agora?
O futuro da genômica e da genética do camundongo na
era pós sequenciamento pode ser facilmente vislumbrada pelos
cientistas. O acesso livre e irrestrito às seqüências depositadas
nos bancos de dados e a contínua melhora na qualidade dessas
seqüências proporcionam a realização de comparações inter-
especíﬁcas. Por exemplo, podemos comparar as seqüências
não codiﬁcadoras conservadas (SCCs) entre várias espécies, tais
como, camundongo, rato, chipanzé, homem e bovino e cruzá-las
com a expressão de genes em diferentes tecidos (transcriptoma).
As informações que poderão surgir dessas comparações, serão
úteis no entendimento da regulação gênica.
Na era pós-sequenciamento, as mutações serão úteis e
poderão contribuir de forma eﬁciente na anotação dos genes
pela comparação da alteração no DNA que gerou a mutação e
seu respectivo fenótipo. De outra forma, através do isolamento
do gene que causou o fenótipo alterado estaremos entendendo
a função deste, ou seja, estaremos estudando e tendo acesso
ás funções dos genes que compõem o genoma através de suas
disfunções.
Existe um abismo entre os mutantes disponíveis e a
quantidade total de fenótipos essenciais para podermos explorar
totalmente o camundongo como um organismo modelo e, assim,
dissecarmos as funções primárias da totalidade dos genes que
compõem nosso genoma (GUÉNET, 2006). Ao examinarmos
cuidadosamente os camundongos portadores de mutações
neurológicas encontramos apenas cinco mutantes [wasted
(wst), progressive motor neuropathy (pmn), neuromuscular
21
Modelo Animal
degeneration (nmd), wobbler (wr) e motor neurone degeneration
2 (mnd2)] que são modelos potenciais de doenças dos
neurônios motores (LUDOLPH, 1996). Esses cinco mutantes
obviamente representam uma pequena fração do número de
genes envolvidos nas funções neuronais e motoras. Por outro
lado, nenhum destes mutantes foi identiﬁcado como modelo
homólogo de doenças humanas e, as para as duas mutações no
homem que afetam os nuerônios motores, não foi encontrado
modelo murino (BRUNIALTI et al.,1995).
Da mesma forma muitas mutações dos camundongos
que conduzem à surdez vêem sendo identiﬁcadas no homem,
estas são associadas com o “sacudir a cabeça” e movimento
circular. Com essas mutações pôde-se entender muito sobre
o desenvolvimento do ouvido interno humano, mas nenhuma
mutação em camundongo foi identiﬁcada levando à perda
progressiva da audição, o que é uma característica comum em
certas pessoas idosas (STEEL et al., 1997).
A expansão da coleção de camundongos mutantes se faz
necessária para identiﬁcar e descrever de novos genes e para
uma melhor compreensão da ação destes genes no metabolismo
geral, permitindo um maior domínio na compreensão da
função gênica em mamíferos (WELLS & BROWN, 2000).
O domínio de técnicas moleculares que “criam” mutações
(ENU, animais knock-in e knockout e mutantes condicionais),
aliado à existência das mutações espontâneas, acelerou o
andamento de estudos sobre o fenótipo, isto é, como o impacto
genotípico de diferentes mutações atua na função normal de
genes críticos. Mesmo com os inúmeros mutantes já isolados e
descritos, o termo “gap (buraco) fenotípico” é bem empregado
para expor um estado de carência de animais mutantes, o que
leva ao sub-aproveitamento do camundongo como organismo
modelo. Para maximizar as potencialidades do camundongo
como modelo, ainda é necessário isolar mais mutantes para
os loci já conhecidos e também gerar mutações em loci ainda
desconhecidos (BROWN & PETERS, 1996).
22
Modelo Animal
Apostando nesta estratégia, muitos laboratórios se
interessam pela abordagem fenotípica, isolando mutantes
induzidos pela ação alquilante do mutágeno ENU (etil-nitroso-
uréia). Este agente mutagênico possui um radical etil transferível
a oxigênios ou nitrogênios presentes nas bases nitrogenadas do
DNA (NOVEROSKE et al., 2000). Os sítios de alquilação estão
presentes em todas as bases do DNA e foram identiﬁcados tanto
in vivo quanto in vitro. Estes sítios incluem os resíduos N1, N3
e N7 da adenina; O6, N3 e N7 da guanina; O2, O4 e N3 da
timina e O2 e N3 da citosina. A base transformada, então, passa
a mimetizar uma outra base durante a replicação da dupla-ﬁta
de DNA, fazendo com que a mutação se ﬁxe no genoma após
dois ciclos de replicação celular, já que o mecanismo impede
a ação eﬁciente do sistema de reparo celular. O ENU gera
mutações de ponto (além de pequenas deleções e inserções)
em todo o genoma. Comparativamente às outras drogas
mutagênicas, como, por exemplo, clorambucil, ENU apresenta
a maior taxa de mutação, da ordem de 1,5-6 x 10-3. De todas
as mutações induzidas por ENU e que foram seqüenciadas,
foram detectadas mutações de sentido trocado (64%), mutações
sem sentido (10%) e erros de splicing (26%) (JUSTICE et al.,
2000). Os animais tratados com ENU (geralmente machos, pois
toleram bem o tratamento e geram uma grande quantidade de
espermatogônias mutantes) são cruzados para observação dos
mutantes na prole, que serão posteriormente caracterizados
fenotípica e geneticamente. Sendo o ENU um alquilante que
age aleatoriamente no genoma, conseqüentemente pode induzir
mutações em qualquer ponto de determinado gene, permitindo
a avaliação de todo um espectro de alterações na seqüência
(BEIER, 2000).
Muitos projetos buscaram recuperar alelos mutantes
especíﬁcos induzidos por ENU no genoma murino. Em um deles,
metade da ninhada obtida dos casais onde o macho foi tratado
com ENU apresentou mutações recessivas que segregavam
de forma mendeliana (KASARKIS et al., 1998). Em outro, foi
utilizado um sistema de sensibilização da prole com injeções
de fenilalanina para evidenciar mutantes em genes na via
23
Modelo Animal
metabólica da fenilalanina (SYMULA et al., 1997). Um terceiro
projeto conseguiu com a administração de ENU obter uma série
alélica para o locus quaking (qk), essencial na mielinização
axonal e importante em processos embriogênicos iniciais (COX
et al, 1998). Ainda, outro projeto teve como interesse principal
isolar fenótipos oculares mutantes e anormalidades na visão
causadas por mutações induzidas por ENU, sendo que 25
linhagens murinas mutantes puderam ser isoladas (THAUNG
et al., 2002). Dentre estas mutações, algumas foram mapeadas
em regiões do genoma que não possuem genes candidatos,
indicando a presença de novos genes. Projetos em larga escala
também foram realizados por vários laboratórios que têm como
especialidade gerar mutantes. Analisando 26.000 tratados com
ENU, Nolan e colaboradores (NOLAN et al., 2000) puderam
isolar 500 mutações novas envolvendo problemas nos
membros, malformações caudais e craniofaciais. Outro grupo
isolou mutações dominantes e recessivas após análise de 14.000
animais da prole de intercruzamentos e retrocruzamentos
envolvendo animais tratados com ENU, o que possibilitou a
identiﬁcação de 182 novas mutações em diversos fenótipos (de
ANGELIS et al., 2000).
Apenas cerca de 5% dos estimados 30.000-40.000
genes que compõe o genoma murino possuem mutações
isoladas, a maioria destas sendo mutações dirigidas por
processo de recombinação homóloga em células tronco
embrionárias (PERKINS, 2002). A abordagem fenotípica que
utiliza ENU como agente mutagênico
aposta no isolamento de
alelos mutantes de interesse e no estabelecimento de linhagens
mutantes modelo para doenças humanas. Hoje, virtualmente
todos os projetos de indução de mutações com agentes
químicos utilizam preferencialmente ENU aos outros compostos
(WILLIAMS, 2003). A enorme coleção de mutações já isoladas,
mapeadas e estudadas, aliada ao potencial já demonstrado do
camundongo como organismo modelo, vem permitindo aos
especialistas vasculhar cada detalhe genético envolvido nos
processos metabólicos de vertebrados. Certamente, este maior
entendimento da função gênica vem do estudo de mutantes
(Soewarto et al., 2000).
24
A MUTAÇÃO PROGRESSIVE MOTOR NEURONOPATHY
(pmn)
Descrição clínica
A mutação progressive motor neuronopathy (pmn) foi
observada pela primeira vez pelo pesquisador Dr. Schmalbruch,
em 1988, no Instituto de Panum, em Copenhagem, numa criação
de camundongos com um background genético desconhecido
(NMRI) (SCHMALBRUCH; SKOVGAARD JENSEN, 1990). Desde
sua descoberta, essa mutação é considerada o modelo animal
de uma amiotroﬁa espinal humana (SCHMALBRUCH et al.,
1991).
Essa patologia é transmitida de modo autossômico
recessivo. Os animais homozigotos pmn/pmn são identiﬁcados
entre 15 a 18 dias após o nascimento por meio de uma
locomoção incerta e pelo começo de uma atroﬁa muscular dos
membros posteriores e da cintura pélvica. Quando levantamos
os animais doentes pela cauda, estes não têm o reflexo de
esticarem as patas traseiras como o fazem os animais normais
(Figura 6). Após alguns dias de evolução da doença, os músculos
das patas anteriores ﬁcam igualmente atroﬁados e os animais
morrem entre a 6ª e a 7ª semana de vida, provavelmente de
uma paralisia respiratória (relacionada ao problema envolvendo
o diafragma descrito logo em seguida) ou, em alguns casos,
por desnutrição, pois são incapazes de se locomoverem até o
local da ração. Quando os sinais clínicos de fraqueza muscular
posterior estão claramente visíveis, os animais mutantes têm um
peso inferior a 40% do normal. Entretanto, nunca foi observada
tremedeira ou cãimbra durante a evolução da doença.
Dados anatomopatológicos
Músculos e nervos periféricos
Os músculos dos membros posteriores dos camundongos
homozigotos (pmn/pmn) com idade de cinco semanas mostram
25
A Mutação Progressive Motor Neuronopathy (pmn)
uma atroﬁa neuronal dos grupos de ﬁbras angulares (Figura 7a). A
presença de ﬁbra hipertroﬁada é rara. Os músculos dos membros
anteriores desses camundongos apresentam pouquíssimas
ﬁbras atroﬁadas. As junções neuromusculares estão cobertas de
terminações axonais degeneradas ou por células de Schawnn
isoladas (Figura 7b; c). Os axônios terminais estão inchados e
as vesículas das sinapses não estão presentes. O nervo ciático
mostra sinais de degeneração axonal (Figura 7d).
Nos animais mutantes com 5 a 6 semanas de idade, o
número de axônios mielinizados no nervo ﬁbular comum é
inferior a 30% com relação aos animais normais.
Algumas anomalias podem ser visualizadas no nervo
frênico desde a quarta semana após o nascimento dos animais
mutantes. Nesses animais, esse nervo é mais ﬁno e é encontrado
um grande número de axônios degenerados (Figura 8a, b).
A perda das ﬁbras no nervo frênico sugere que o
diafragma também sofra de tal perda desde a quarta semana, o
que causaria a morte dos animais por parada respiratória.
Medula Espinal
Nos animais mutantes, tanto a medula espinal cervical
como a lombar parecem normais. O número e a repartição das
células na corno ventral também são normais. Também não
foi observada nenhuma degeneração acompanhada ou não de
uma proliferação de células gliais.
Durante a quinta semana de vida, uma pequena
quantidade de axônios degenerados pode ser visualizada na
região superﬁcial do funículo ventral e, no decorrer da sexta
semana, quando, então, os animais estão na fase terminal da
doença, observam-se ﬁbras degeneradas no fascículo grácil e
no fascículo próprio lateral e fascículo próprio dorsal.
No cérebro dos animais mutantes não foi observada
nenhuma anomalia, exceto pelo seu peso, que é 30% inferior
ao peso do cérebro de um animal normal.
26
A Mutação Progressive Motor Neuronopathy (pmn)
Resumidamente, podemos dizer que essa doença,
primeiramente, apresenta uma fraqueza muscular dos membros
posteriores e da cintura pélvica; o déﬁcit do número de ﬁbras no
nervo ﬁbular comum chega a 30% na quinta semana. Entretanto,
desde a quarta semana, pode-se notar uma anomalia no nervo
frênico, provavelmente devida a sua desmielinização (perda
de 69% em média de ﬁbras). Essa degeneração provavelmente
é a causadora da morte dos animais, pois pode levar a uma
insuﬁciência respiratória. Não foi observada nenhuma
diminuição no número de ﬁbras nas raízes nervosas ventrais,
nem no número de neurônios motores. Nenhuma vacuolização
do corpo celular dos neurônios motores foi observada.
Em contrapartida, foi observada uma cromatólise das
células da corno ventral por microscopia eletrônica. A grande
ﬁbra dessa região da medula espinal tem um tamanho inferior
ao normal, pois está desconectada dos neurônios motores e
seus alvos. A conservação na quantidade de corpos celulares
na córnea anterior sugere que a doença pmn é causada por um
processo de morte retrógrada, em que os problemas se iniciam
nas terminações nervosas e progridem ao longo do axônio em
direção ao corpo celular, sem jamais atingir esse último, pois,
talvez, os animais morram antes.
Essa mutação foi utilizada para testar a eﬁciência de
algumas tentativas de terapia gênica. A administração do
CNTF (ciliary neorotrophic factor), sintetizado por ﬁbroblastos
geneticamente modiﬁcados e transplantados no início da
doença, diminui a velocidade da evolução da enfermidade,
mas não chega a pará-la completamente (SAGOT et al., 1995b;
SENDTNER et al., 1992). A superexpressão do proto-oncógeno
Bcl-2 nos animais doentes não altera a evolução da doença
nem sua gravidade; ela não impede a degeneração axonal, mas
reduz a perda neuronal no núcleo facial (SAGOT et al., 1995b).
A administração de um fator neurotróﬁco como o GDNF produz
efeitos similares ao Bcl-2 (SAGOT et al., 1996). Esses resultados
tendem a provar que, nessa mutação, o processo patológico não
é um problema primário no corpo celular. A mutação levaria a
27
A Mutação Progressive Motor Neuronopathy (pmn)
uma neuropatia, e não a uma axonopatia. Além disso, os estudos
mostram que (1) os mecanismos que levam a uma axonopatia
são independentes daqueles que causam uma neuropatia; (2) os
fatores neurotróﬁcos agem de forma diferente uns dos outros.
28
O PRINCÍPIO GERAL DA CLONAGEM POSICIONAL
A estratégia da clonagem posicional (COLLINS, 1992),
também chamada genética inversa ou reversa (RUDDLE, 1984;
ORKIN, 1986), consiste em se isolar um gene identiﬁcado
unicamente por um fenótipo mutante por meio da identiﬁcação
do menor fragmento de DNA que o contenha e, em
seguida, identiﬁcarem-se, nesse fragmento, suas seqüências
codiﬁcadoras. Para essa estratégia, a priori, não se faz necessário
um conhecimento prévio do produto do gene procurado nem
do tecido em que ele seja expresso. Entretanto, ﬁca claro que,
quanto menos informações tivermos do gene procurado, mais a
tarefa da clonagem promete ser difícil e longa.
A clonagem posicional foi utilizada pela primeira vez
por Bender e seus colaboradores para isolar o complexo
bithorax de drosóﬁla (1983). Em 1995, já possuíamos 65 genes
humanos (COLLINS, 1995) e cerca de 30 genes murinos foram
isolados por meio dessa estratégia. Entre os inúmeros sucessos
podemos citar, no homem, a clonagem do gene responsável
pela doença chamada Distroﬁa Muscular de Duchenne,
que codiﬁca a proteína distroﬁna (MONACO et al., 1986), a
clonagem do gene responsável
pela Coréia de Huntington (THE
HUNTINGTON’S DISEASE COLLABORATIVE RESEARCH
GROUP, 1994), a clonagem do gene de susceptibilidade ao
câncer de seio (BCRAI, MIKI et al., 1994), a do gene responsável
pelos três tipos de amiotroﬁa espinal humana (LEFEBVRE et
al., 1995) e, enﬁm, a clonagem de uma helicase responsável
pela Síndrome de Werner (YU et al., 1996), para a qual foi
preciso seqüenciarem-se mais de 650.000 pares de bases e
testarem-se inúmeros genes candidatos para se chegar ao gene
responsável. Nos camundongos, a clonagem mais sensacional
foi a do gene responsável pela mutação obese (ob) (Figura 9),
que se tornou um modelo da obesidade humana de caráter
autossômico recessivo (ZHANG et al., 1994). Outros sucessos
foram registrados, como o gene shaker-1 (sh1) (GILSON et al.,
1995) e beige (bg) (BARBOSA et al., 1996), o qual se revelou um
modelo da doença de Chediak-Higashi humana.
29
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
A clonagem posicional de um gene acontece em três
etapas.
Em um primeiro momento, efetuamos o mapeamento
genético da mutação estudada, ou seja, localizamos o
cromossomo que carrega o lócus responsável pela mutação.
Para tanto, na grande maioria das vezes, precisamos efetuar
cruzamentos especiais para alcançarmos tal objetivo. Esse
cruzamento envolve a linhagem na qual a mutação apareceu e
uma outra, a ﬁm de mobilizarmos um alto grau de polimorﬁsmo,
essencial ao trabalho de mapeamento. Nessa fase, tentamos
encontrar os dois marcadores mais próximos do lócus mórbido
e calculamos a distância genética (centiMorgan, cM) que os
separa.
Desde que tenhamos conseguido restringir ao máximo o
intervalo genético que contenha a mutação, começamos, então,
o que chamamos “marcha sobre o cromossomo”. Nessa etapa,
nós iremos construir o mapa físico da região cromossômica
estudada. Para tanto, fragmentos de DNA clonados são alinhados
uns após os outros, formando o que chamamos de um contig
da região. A caracterização desse contig deﬁne a construção
do mapa físico, em que as distâncias entre os marcadores serão
medidas em pares de bases de nucleotídeos. As extremidades
do contig correspondem aos dois marcadores que englobam
o lócus da mutação, deﬁnido pelo estabelecimento do mapa
genético concluído na primeira etapa do trabalho de clonagem
posicional.
Enﬁm, passamos à fase de recuperação das seqüências
codiﬁcadoras contidas no DNA do contig. Essas seqüências são,
em seguida, caracterizadas para que possamos deﬁnir o perﬁl
de um gene que será, então, nosso gene candidato. Atenção,
aqui estamos isolando a cópia normal do gene responsável pela
mutação, o que é diferente da fase de mapeamento, quando,
então, localizamos a versão mutante do gene.
As etapas da clonagem posicional estão ilustradas na
Figura 10 e serão detalhadas a seguir.
30
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
O mapeamento genético
O objetivo do mapeamento genético é deﬁnir a ordem
linear dos genes sobre os cromossomos e deﬁnir as distâncias
que os separam. O mapa genético que deve ser estabelecido na
primeira fase da clonagem posicional é construído através da
procura de ligação entre o lócus mutante e marcadores genéticos
vizinhos previamente localizados sobre os cromossomos. Para
tanto, identiﬁcamos primeiramente o cromossomo que porta
a mutação e, em seguida, devemos aﬁnar esse mapeamento.
Nessa fase do trabalho, a descoberta de alguma anomalia
citogenética (translocação, deleção) associada à doença pode
facilitar, e muito, o desenrolar da clonagem.
O mapeamento da mutação sobre um cromossomo particular
O primeiro passo para o mapeamento da mutação é, como
já foi mencionado anteriormente, identiﬁcar o cromossomo
que a contenha. Atualmente, os cruzamentos realizados nos
laboratórios são altamente polimórﬁcos e os marcadores
utilizados são, na maior parte das vezes, moleculares. Essa
primeira etapa é, então, confundida com a segunda, a qual
consiste em gerar um mapa genético de alta resolução em torno
do lócus mutante localizado. Na época em que os marcadores
utilizados no mapeamento eram, eles mesmos, mutações
identiﬁcáveis unicamente por um fenótipo anormal, muitas
vezes inviáveis ou inférteis, precisávamos realizar inúmeros
cruzamentos e gerar um enorme número de animais para
conseguirmos, às vezes, identiﬁcar um possível cromossomo
interessante.
Dois tipos de cruzamento são geralmente realizados
nessa primeira etapa (GREEN, 1995): o retrocruzamento e o
intercruzamento. Os princípios desses dois cruzamentos estão
ilustrados na Figura 11.
Se considerarmos vários marcadores quaisquer – a, b, c,
d, ... –, já localizados sobre o mapa genético dos camundongos,
e m, o alelo mutante a ser localizado, o tipo de cruzamento a ser
31
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
estabelecido é, quase sempre, imposto por razões práticas. Em
geral, cruzamos uma linhagem de camundongo homozigota para
os marcadores polimórﬁcos com a linhagem em que a mutação
m está sendo mantida. Caso a mutação seja compatível com a
fertilidade, ao menos em um dos dois sexos, nós utilizamos um
animal homozigoto m/m para produzir a geração F1, depois a
F2, cruzando-se os F1 entre si.
No caso em que os animais homozigotos mutantes forem
incompatíveis com a reprodução, o que acontece na maior
parte do tempo, o procedimento é um pouco mais complicado:
precisamos cruzar os animais heterozigotos portadores do alelo
mutante +/m com a linhagem de camundongo homozigota
(aquela que porta os marcadores moleculares a, b, c, d, ...,
no estado homozigoto) e, em seguida, recruzar os animais F1
entre si até que o fenótipo mutante reapareça na geração F2
(animais homozigoto m/m). Evidentemente, para esse caso, no
qual não podemos contar com os animais homozigotos, muitos
cruzamentos serão realizados sem interesse cientíﬁco, pois
irão associar, aleatoriamente, um parceiro +/m com um outro
+/+ e mesmo dois parceiros +/+. Enﬁm, o DNA dos animais F2
mutantes é extraído e tipado para os marcadores moleculares
repartidos sobre todos os cromossomos. Com os métodos
modernos disponíveis para o mapeamento como, por exemplo,
a reação em cadeia da polimerase (PCR), são necessárias apenas
algumas semanas para tipar mais de 50 marcadores moleculares
distribuídos de forma homogênea por todo o genoma animal.
A descoberta de uma ligação ﬁca evidenciada quando um
ou mais marcadores se encontram constantemente, ou muito
freqüentemente, associados à mesma fase (em união ou em
repulsa) do fenótipo mutante. Isso quer dizer que o marcador
tipado pela PCR e o alelo mutante m fazem parte do mesmo
haplótipo.
A construção de um mapa genético de alta densidade e de alta
resolução ao redor do gene mutado
O objetivo dessa segunda parte do mapeamento genético
do gene de interesse é determinar os dois marcadores mais
32
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
próximos do lócus da doença e que o enquadrem no menor
intervalo cromossômico possível para podermos ter a certeza de
que o “encurralamos”. O tamanho do intervalo a ser determinado
depende da quantidade de marcadores polimórﬁcos disponíveis
na região. A precisão com a qual essa dimensão é apreciada
depende do número de meioses analisadas. É indispensável a
elaboração, no início do trabalho, de um cruzamento altamente
polimórﬁco e a análise de um grande número de meioses
(várias centenas), se quisermos estabelecer o mapeamento com
precisão. A Figura 12 mostra como proceder para identiﬁcar
os animais, ditos informativos, no caso de um retrocruzamento,
através da genotipagem com dois marcadores que enquadram o
intervalo genético crítico que contém o lócus mutado.
Desde que nenhum evento de recombinação tenha sido
observado em n meioses analisadas, podemos calcular que o
limite superior do intervalo de conﬁança r da distância
entre
dois marcadores, com o risco de primeira espécie p, é dado
pela fórmula:
r = 1 – n p
com:
p: rico de primeira espécie
n: número de meioses
r: distância entre os marcadores
Dessa forma, podemos calcular que, para 1.000 meioses
analisadas, o fato de não obtermos recombinantes entre dois
marcadores indica que a distância genética que os separa é
inferior a 0,3 cM, com um risco de 5%. Esta distância de 0,3
cM corresponde a, aproximadamente, 600 kb de DNA dos
camundongos1.
As linhagens de camundongos utilizadas nos cruzamentos
devem ser escolhidas de forma adequada a ﬁm de se obter um
bom compromisso entre o grau de polimorﬁsmo e a taxa de
reprodução. Os cruzamentos intraespecíﬁcos, feitos entre as
33
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
linhagens isogênicas tradicionais, as quais foram derivadas de
uma mesma espécie selvagem Mus musculus domesticus, são
fáceis de serem realizados; entretanto, o grau de polimorﬁsmo
mobilizado é relativamente baixo e, na maior parte das vezes,
não permite o estabelecimento de um mapa genético denso.
Bonhomme e Guénet (1979 e 1982) (Figura 13) foram os
primeiros que contornaram essa situação ao mostrarem que
poderíamos estabelecer cruzamentos entre camundongos de
espécies diferentes como, por exemplo, espécies Mus musculus
domesticus (linhagem de laboratório) e Mus spretus (linhagem
selvagem). Com esse tipo de cruzamento, muito embora envolva
espécies diferentes, é possível a obtenção de híbridos viáveis nas
condições de laboratório. Dada a divergência evolutiva que as
separa, o grau de polimorﬁsmo mobilizado é alto e facilmente
identiﬁcável (GUÉNET; BONHOMME, 2003)2. Entretanto,
os cruzamentos implicando a espécie Mus spretus têm dois
inconvenientes: o primeiro diz respeito ao fato de os animais F1
só poderem ser obtidos através do pai selvagem Mus spretus,
pois o cruzamento recíproco é muito difícil de ser realizado. O
segundo inconveniente refere-se ao fato de os animais machos
F1 serem estéreis (efeito Haldane).
1. De acordo com as estimativas mais recentes, o mapa genético dos camun-
dongos tem 1600 cM e seu genoma contém, como no homem, 3 X 109 pares
de bases. Nós consideramos que, em média, 1 cM equivale a 1,8 Mb. Essa
extrapolação deve ser vista com muito cuidado, pois, embora o evento de
recombinação seja definido como um fenômeno aleatório, ele não ocorre de
maneira homogênea por todo o genoma. Desde que a recombinação ocorra
com uma alta freqüência numa determinada região genômica, nessa região
as distâncias genéticas são maiores que as distâncias físicas. Essa situação é
favorável na clonagem posicional. No caso contrário, a situação é muito mais
complexa. Devemos notar que o homem recombina duas vezes mais que o
camundongo, e seu mapa genético tem 2100 cM.
2. Experimentos de seqüenciamento mostraram que, em média, uma base a
cada 30 eram diferentes entre animais da linhagem C57BL/6, derivada prin-
cipalmente da espécie Mus musculus domesticus, e animais SEG, derivados
da espécie Mus spretus. Tal densidade polimórfica permite, teoricamente,
a realização de mapas genéticos muito densos.
34
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
As vantagens desses cruzamentos intraespecíﬁcos e
interespecíﬁcos podem ser acumuladas utilizando-se linhagens
consômicas nas quais um único cromossomo é do tipo Mus
spretus. Nesse caso, podemos obter resultados muito próximos
aos dos cruzamentos interespecíﬁcos, eliminando as diﬁculdades
de reprodução e conservando o alto grau de polimorﬁsmo
(FLETCHER et al., 1991).
Quando um cruzamento for estabelecido para o
mapeamento de uma mutação, é importante que possamos
identiﬁcar, sem nenhuma ambigüidade, os animais homozigotos
mutantes na descendência. Isso, infelizmente, nem sempre
é o caso. Freqüentemente, uma mutação pode ter efeitos
variáveis em gravidade ao passo que os animais de genótipo
mutante podem ter características de animais de fenótipo
normal (penetrância incompleta) ou níveis variados de
expressão da patologia (expressividade variável). Nesse caso,
devemos considerar unicamente os animais cujo fenótipo tenha
sido estabelecido com segurança para serem utilizados no
mapeamento; entretanto, o cálculo da distância genética ﬁca
comprometido.
O cálculo das distâncias genéticas, baseado na
identiﬁcação de genótipos recombinantes, necessita do
reconhecimento da origem de cada um dos alelos do marcador
testado nos animais N2 (backcross) ou F2 (intercross). Sabemos
também que essa identiﬁcação só é possível se existir um
polimorﬁsmo entre as duas linhagens utilizadas no cruzamento
inicial.
Os primeiros polimorﬁsmos “moleculares” identiﬁcados
foram os polimorﬁsmos de comprimento de fragmentos de
restrição ou RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism;
BOSTEIN et al., 1980). Os RFLP são causados pela variação na
seqüência de DNA, de forma que um sítio de restrição, talvez
ausente numa linhagem de camundongo, esteja presente numa
outra. Quando da análise por Southern, uma sonda molecular
do gene analisado revela fragmentos de tamanhos diferentes nas
35
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
duas linhagens, identiﬁcando, assim, a origem de cada um dos
dois alelos (Figura 14).
Os microssatélites ou seqüências simples repetitivas
(LOVE et al., 1990) correspondem a seqüências repetidas (de 10
a 40 vezes) de di, tri ou tetra nucleotídeos, sendo a seqüência
mais freqüente a do tipo CA. Existem muitos microssatélites,
relativamente estáveis e distribuídos aleatoriamente ao longo de
todo o genoma humano e de camundongos (cada um conta com
mais de 100.000 microssatélites), exceção feita ao cromossomo
X, no qual encontramos um número pequeno desse tipo de
seqüência (DIETRICH et al., 1994). Os microssatélites são
muito polimórﬁcos entre uma espécie e outra pelo seu motivo
repetido em tandem. A abundância, a estabilidade e a repartição
desses microssatélites fazem deles uma excelente ferramenta no
mapeamento genético: as diferenças de comprimento do número
de repetições são facilmente evidenciadas pela reação em cadeia
da polimerase (PCR), através de iniciadores correspondentes às
seqüências que flanqueiam os microssatélites (Figura 15). O
grupo de Lander (Whitehead/MIT) construiu um mapa genético
de camundongos unicamente com os microssatélites do tipo
(CA)n repartidos sobre a totalidade de cromossomos murino.
Em junho de 1994, mais de 4.000 microssatélites já
tinham sido mapeados com uma resolução de um marcador a
cada 0,35 cM (DIETRICH et al., 1992, DIETRICH et al., 1994).
Hoje mais de 13.000 marcadores estão disponíveis com uma
resolução de 0,1 cM, ou seja, um marcador a cada 560 Kb. Mais
de 1.200 RFLP inicialmente mapeados foram integrados a esse
mapa, que pode ser acessado no endereço eletrônico www.
genome.wi.mit.edu/cgi-bin/mouse/index.
Os minissatélites (JEFFREYS et al., 1985) ou VNTR
(número variável de repetições em tandem) são formados a
partir de um grande número de repetições de uma seqüência
de aproximadamente 50pb, que são marcadores igualmente
polimórﬁcos e distribuídos de forma aleatória por todo o
genoma. Como são muito grandes para serem ampliﬁcados pela
PCR, são muito pouco utilizados.
36
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
Em 1995, McCarthy e seus colaboradores identiﬁcaram e
mapearam mais de 450 novos marcadores polimórﬁcos, os quais
foram isolados pela ampliﬁcação (PCR) das seqüências únicas
compreendidas entre as seqüências longas repetitivas (LINE) ou
seqüências curtas repetitivas (SINE) do genoma animal. Esses
marcadores são diferentes dos microssatélites e RFLP e, dessa
forma, completaram o mapa genético estabelecido por Lander.
A técnica de análise pela SSCP (polimorﬁsmo de
conformação de DNA de ﬁta simples) (ORITA et al., 1989) permite
a detecção de diferenças acontecendo
em uma única base nas
duas ﬁtas de DNA. Essa técnica detecta 70 a 90% de mutações
nos fragmentos de DNA de 200pb ou mais. A sensibilidade de
tal método diminui com o aumento do tamanho do produto a
ser analisado. Essa estratégia, ilustrada na Figura 16, é muito útil
na detecção de polimorﬁsmos ou de mutações pontuais entre
um DNA mutante e um normal.
Para a genética de camundongos existem mapas genéticos
de referência, que são regularmente atualizados e publicados
nas revistas cientíﬁcas Mammalian Genome e Mouse Genome,
bem como bases de dados acessíveis via Internet: MGD (Mouse
Genome Database) www.informatics.jax.org. Todos os genes ou
marcadores localizados no mapa genético podem ser utilizados
como fonte de marcadores polimórﬁcos.
O estabelecimento de uma ligação genética para uma
dada mutação permite, muitas vezes, prever sua localização no
mapa genético da espécie humana. Para tanto, só precisamos
consultar os mapas de homologia de sintenia já estabelecidos e
publicados (PETERS and SEARLE, 1996). Falamos de conservação
ou de homologia de sintenia quando dois (ou mais) pares de
marcadores homólogos estão presentes num mesmo segmento
cromossômico em duas (ou mais) espécies diferentes. Por
exemplo, a comparação dos mapas genéticos humano e murino
indica que vários genes localizados sobre o cromossomo 13
de camundongos se encontram nos cromossomos 1, 3, 5, 6, 7,
9, ou 10 humanos. Caso a ordem de posição dos marcadores
37
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
também seja conservada, haverá, então, conservação de
sintenia (Figura 17).
Quando uma ligação for estabelecida numa região
“pobre” em marcadores podemos obter outros marcadores por
meio da técnica de microdissecção do DNA da região localizada,
ampliﬁcá-la pela PCR com a ajuda de oligonucleotídeos
degenerados e, em seguida, clonar os produtos ampliﬁcados
(SCALENGHE et al., 1981, LUDECKE et al., 1990, TELENIUS et
al., 1992). A microdissecção foi utilizada para os camundongos,
na produção de novas sondas da região do complexo T/t do
cromossomo 17 (ROHME et al., 1984).
Antes de concluirmos a seção que concerne ao
estabelecimento de um mapa genético de alta densidade na
vizinhança do gene que desejamos clonar, temos de falar de
um ponto importante relativo ao princípio do estabelecimento
dos mapas genéticos, os quais são graduados em unidade
de recombinação, ou seja, em centiMorgan (cM). Sabemos,
entretanto, que não existe nenhuma relação linear entre a
freqüência de recombinação, que nos indica a distância
genética, e a distância física real entre os marcadores, a qual é
estabelecida em pares de base. Em alguns casos, a freqüência
de recombinação é alta e a distância genética equivale a uma
distância física pequena. Em outros casos, a recombinação é
rara e a distância genética corresponde a uma grande distância
física. Geralmente, a freqüência de recombinação depende do
sexo no qual a meiose ocorreu (no caso dos camundongos, na
maior parte das vezes, estamos analisando a meiose do sexo
masculino) e, de qualquer maneira, ela não é a mesma de um
segmento cromossômico a outro. Temos que saber igualmente
que rearranjos estruturais dos cromossomos (deleções,
translocações, inversões, etc) modiﬁcam consideravelmente
a freqüência de recombinação (HERMANN et al., 1987). Um
mapa genético de alta densidade estabelecido numa região de
alta freqüência de recombinação simpliﬁcará muito a tarefa
da clonagem posicional. De forma inversa, a co-segregação
de um marcador com o lócus do gene a ser clonado não é
38
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
necessariamente um sinal de que haja uma grande proximidade
física.
Microssatélites X SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)
A introdução dos marcadores microssatélites no início
dos anos 90 possibilitou aumentar dramaticamente a eﬁciência
dos estudos genéticos. O mapeamento à alta resolução passou
a ser uma realidade. O mapeamento genético de microssatélites,
baseado na diferença (polimorﬁsmo) do número de unidades
de repetição encontrada nas linhagens de camundongos, é
facilmente realizado através da técnica da reação em cadeia da
polimerase (PCR). Mais de 6000 microssatélites são comumente
usados no mapeamento genético em camundongos. Estima-se
que os tamanhos genético e físico do genoma dos camundongos
sejam, respectivamente, 1500 cM e 3000 Mb (3X109 pb). Assim,
o espaço médio entre os microssatélites pode ser availado em
0,25 cM ou 500 Kb. Isto é um cálculo aproximado, visto que, as
distâncias genéticas nem sempre refletem as distâncias físicas,
pois sabemos que determinadas regiões do genoma sofrem
um maior número de eventos de recombinação que outras.
De qualquer forma, o mapeamento através dos microssatélites
pode oferecer uma considerável resolução, porém não
necessariamente a exigida para a clonagem posicional. Deve
se lembrado que, embora tenhamos 6000 microssatélites
disponíveis, nem todos são polimórﬁcos entre todas as linhagens
de camundongo. Assim, existe a necessiadade de outros tipos de
marcadores polimórﬁcos que possam auxiliar no mapeamento
à alta resolução.
Com o sequenciamento de vários genomas, um novo
tipo de marcador molecular fez sua aparição, os SNPs (Single
Nucleotide Polymorphisms, para polimorﬁsmo de nucleotídeo
único. Como o nome indica, um SNP envolve a mudança em um
único nucleotídeo. Geralmente é uma substituição, mas também
pode ser uma deleção ou inserção. Já foram identiﬁcados mais de
4 milhões de SNPs no genoma humano e eles estão distribuídos
pelo genoma, fornecendo marcadores extremamente úteis para
o mapeamento à alta resolução e também para os estudos de
39
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
associação à procura de loci que conferem susceptibilidade a
doenças comuns.
Para o genoma murino o número de SNPs disponíveis
ainda é bem modesto, um pouco mais de 3000 no banco de
dados do MIT, porém o potencial da existência de SNPs entre
as linhagens isogênicas é enorme. Como o sequenciamento de
diversas linhagens de camundongo está sendo realizado, hoje
já temos os dados de 15 delas, podemos aﬁrmar que a situação
desses marcadores vai melhorar e muito. A previsão para breve
é da disponibilidade de 1 milhão de SNPs distribuídos ao longo
de todo o genoma murino, o que signiﬁca uma densidade de
1 SNP a cada 3 Kb. Podemos, desta forma, prever que esses
marcadores irão substituir os microssatélites num futuro bem
próximo.
O mapeamento físico
Quando dois marcadores genéticos muito próximos do
gene de interesse foram isolados, o segmento de DNA situado
entre esses dois marcadores, no qual o gene em questão deverá
estar contido, deverá, então, ser isolado ﬁsicamente. Para tanto,
as técnicas de clonagem clássicas que se servem de plasmídios,
fagos lambda ou cosmídios não são adequadas. Na realidade, tais
técnicas só permitem a manipulação de pequenos fragmentos
de DNA, algumas dezenas de Kb no máximo. Se considerarmos
que o intervalo genético deﬁnido na etapa anterior é da ordem
de 1cM, ou seja, por volta de 1.700pb nos camundongos, não
podemos ter a certeza, a priori, de que os sítios de clonagem
estão repartidos de tal maneira que façam com que todo DNA
contido no segmento possa ser clonado.
O que vimos é que a clonagem posicional só pôde
progredir deﬁnitivamente após a construção de ferramentas
adequadas e que, sem a eletroforese em campo pulsado, sem
o desenvolvimento dos cromossomos artiﬁciais de levedura
(YAC) e sem a descoberta dos marcadores microssatélites, essa
estratégia de clonagem não teria conhecido o sucesso de que
desfruta hoje em dia.
40
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
A eletroforese em campo pulsado
A eletroforese em agarose ou em poliacrilamida clássica
permite a separação de fragmentos de DNA graças ao papel
das malhas que
formam o gel. Sob a ação do campo elétrico,
algumas moléculas de DNA migram entre todos os poros,
enquanto que outras moléculas maiores não podem migrar entre
alguns dos poros e vão levar um tempo maior para percorrer o
mesmo percurso.
As grandes moléculas de DNA (de mais de 20Kb) são
maiores que todos os poros de resolução do gel. Sob a ação
do campo elétrico, essas moléculas sofrem uma modiﬁcação
estrutural de maneira a migrar em bloco nos interstícios
maiores. Esses fragmentos migram todos na mesma velocidade,
independentemente do tamanho, e não existe mais separação
alguma. A eletroforese em campo pulsado resolveu esse
problema por meio da modiﬁcação periódica da orientação do
campo elétrico. A molécula deve mudar sua conformação e se
reorientar paralelamente ao campo. Para esquematizar, podemos
dizer que uma molécula de DNA muito longa (1.000Kb) precisa
de muito tempo para se reorientar e ela tem pouco tempo para
migrar, enquanto que uma molécula menor (100Kb) necessita
de pouco tempo para se reorientar e consagra a maior parte do
seu tempo a migrar. Três sistemas são utilizados:
OFAGE (Orthogonal-Field Alternating Gel •
Eletrophoresis) (SCHUWARTZ; CANTOR, 1984): nesse caso os
eletrodos estão orientados a 90° e geram dois campos elétricos
alternados e não homogêneos;
CHEF (Contour Clamped Homogenous Field) (CHU •
et al., 1986): é o sistema mais utilizado. Nele, os eletrodos estão
arrumados regularmente ao longo de um circuito em forma de
um hexágono. O campo elétrico é uniforme para todo o gel,
mas a orientação é periodicamente modiﬁcada de 120°. Esse
sistema foi utilizado neste trabalho;
FIGE (Field Inversion Gel Eletrophoresis) (CARLE et •
al., 1986): neste caso, o campo elétrico é uniforme e invertido
de 180°.
41
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
Uma descrição mais detalhada da eletroforese em
campo pulsado pode ser obtida no artigo “Towards a molecular
description of pulse-ﬁeld gel electrophoresis”, de Bustamante e
outros, publicado em 1993.
Os PAC, YAC e BAC
Os cosmídios permitem a clonagem de segmentos de
DNA de até 40Kb. O bacteriófago P1, aliado à eﬁciência de
infecção dos bacteriófagos e à simplicidade de manipulação dos
plasmídios, pode conter inserções de até 100Kb (STERNBERG,
1990).
Um enorme avanço para o mapeamento físico foi a
descoberta de que grandes fragmentos de DNA de até 2.000Kb
poderiam ser propagados sob a forma de cromossomos artiﬁciais
de levedura ou YAC (BURKE et al., 1987). O princípio da
clonagem está ilustrado na Figura 18. Os YAC permitem, além
da clonagem de grandes fragmentos de DNA, a de fragmentos
de DNA os quais não tinha sido possível isolar de E. coli. Por
exemplo, as regiões de DNA do cromossomo 7 humano que não
puderam ser clonadas em E. coli (ROMMENS et al., 1989) foram
facilmente clonadas sob a forma de cromossomo artiﬁcial de
levedura em Saccharomyces cerevisiae (GREEN; OLSON, 1990).
Infelizmente, os YAC apresentam um alto grau de quimerismo
(de até 60% em alguns casos), resultante da maneira como
são realizadas as clonagens. Eles são igualmente instáveis e de
manipulação relativamente difícil.
O quimerismo é caracterizado pela presença, num
mesmo YAC, de segmentos de DNA provenientes de
cromossomos diferentes, resultado de uma co-ligação no
momento da construção da biblioteca ou da recombinação
dos clones nas etapas posteriores (GREEN et al., 1990). Alguns
YAC são instáveis e também podem deletar fragmentos de seus
insertos, mas essa instabilidade pode ser reduzida no momento
da construção da biblioteca pela escolha de uma linhagem de
levedura deﬁciente em gene de recombinação (CHARTIER et
al., 1992). A manipulação dos YAC sempre necessita do recurso
42
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
da eletroforese em campo pulsado e é difícil consegui-lo na sua
forma pura, desprovida do DNA de levedura.
Os BAC (Bacterial Artiﬁcial Chromosomes; SHIZUYA et
al., 1992) (Figura 19) permitem a clonagem de fragmentos que
podem chegar até 350kb. Os fragmentos são propagados na
bactéria E. coli, dentro de um vetor de clonagem derivado do
fator F. O vetor está presente em pequeno número de cópias
nas células hospedeiras, o que de certa forma confere uma
relativa estabilidade aos insertos. Na realidade, a porcentagem
de clones quiméricos não ultrapassa 5%. Podemos aﬁrmar que
esse sistema é uma alternativa interessante ao do YAC, para
aplicações que requerem a clonagem de grandes fragmentos
de DNA.
Várias bibliotecas de PAC, YAC e BAC humanas e dos
camundongos estão atualmente disponíveis comercialmente. Os
clones de interesse podem ser isolados dessas bibliotecas por
meio da PCR e hibridização através dos marcadores moleculares
utilizados no mapeamento genético.
Salto e caminhada sobre o cromossomo: chromosome jumping
e chromosome walking
O jumping, ou salto sobre o cromossomo (COLLINS;
WEISSMAN, 1984, POUTSKA; LEHRACH, 1986), consiste na
obtenção da justaposição, dentro de um mesmo clone, de
duas seqüências de DNA situadas nas extremidades de um
grande fragmento de restrição. O princípio dessa técnica está
apresentado na Figura 20. Essa técnica, que é pouco utilizada
depois do desenvolvimento dos cromossomos artiﬁciais de
levedura, permite efetuar várias centenas de Kb.
O walking, ou a marcha sobre o cromossomo, consiste
em construir um conjunto de clones contínuos, ou contig. As
extremidades do primeiro clone são utilizadas para isolar o
clone seguinte, e assim por diante (Figura 21). A marcha sobre
o cromossomo foi aplicada pela primeira vez por Steinmetz
(STEINMETZ et al., 1982), que clonou um grande fragmento de
43
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
DNA na região do complexo major de histocompatibilidade
na forma de cosmídios superpostos. Quando não temos
informações suﬁcientes, é preciso, então, marchar nas duas
direções, a partir do primeiro clone isolado, até encontrarmos
uma informação (recombinação ou rearranjo cromossômico),
permitindo, assim, saber se o gene de interesse foi alcançado
ou não. O desenvolvimento do YAC permite a construção de
contigs que se estendem por grandes regiões. Por exemplo: um
contig de 8Mb foi reunido na região Xq24-q28 do cromossomo
X humano (LiITTLE et al., 1992). Um outro foi construído e cobre
a totalidade da região 21q humana (CHUMAKOV et al., 1992).
Em 1995, Lander e sua equipe no MIT começaram a construção
de contigs de YAC que cobririam integralmente o genoma de
camundongos (DIETRICH et al., 1995). Esse mapa físico, bem
como o realizado com o BAC, está disponível no endereço
eletrônico www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/mouse/index.
Quando o mapa genético é suﬁcientemente denso, nós
podemos, ao menos em teoria, utilizar os marcadores que
flanqueiam o gene que desejamos clonar para isolar os clones
de YAC e tentar organizar um contig da região. Fica claro que,
nessa etapa do trabalho, temos todo interesse em isolar o maior
número possível de YAC e, se possível, a partir de bibliotecas
diferentes, garantir uma melhor cobertura da região.
Isolamento das seqüências codificadoras
A identiﬁcação das seqüências codiﬁcadoras contidas
no DNA do contig constitui uma das principais diﬁculdades da
clonagem posicional. As seqüências codiﬁcadoras representam
apenas uma pequena fração da totalidade do genoma: 5 a
10%. Além disso, as seqüências codiﬁcadoras estão dispersas
e separadas por íntrons de tamanhos variáveis. Um exemplo
extremo disso é, sem dúvida, o da distroﬁna que se estende
sobre 2,3Mb com um RNA mensageiro de 14Kb compreendido
dentro de 79 éxons (ROBERTS et al., 1992). Vários métodos
foram desenvolvidos – todos possuem vantagens e desvantagens,
nenhum é totalmente eﬁcaz e, na prática, convém realizar uma
44
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
combinação de alguns deles para se
obter o gene procurado
(BRENNAN; HOCHGESCHWENDER, 1995).
Conservação ao longo da evolução: Zooblots
A técnica do zooblot (MONACO et al., 1986) consiste
em hibridizar um fragmento do DNA candidato ao DNA de
diferentes espécies por meio da técnica de Southern blot.
Se no DNA candidato existem seqüências codiﬁcadoras,
podemos observar, quase sempre, uma reação cruzada entre
as diferentes espécies representadas no zooblot. Tal fato pode
ser explicado, pois a seqüência dos éxons diverge muito
menos que as seqüências dos íntrons ao longo da evolução.
Essa técnica não permite isolar seqüências codiﬁcadoras, mas
pode ser usada para se saber se o DNA que estamos analisando
possui ou não tais seqüências. Esse DNA pode ser utilizado,
em seguida, no isolamento de mais seqüências a partir de
uma biblioteca de cDNA ou mesmo servir de ingrediente para
outras técnicas. A análise em zooblot de cosmídios inteiros teve
um papel importantíssimo no gene que causa a ﬁbrose cística
humana (ROMMENS et al., 1989) e no gene da obesidade nos
camundongos (ZHANG et al., 1994).
A análise de Northern blot
A hibridização das seqüências candidatas com os RNA
mensageiros sobre um ﬁltro permite determinar o tamanho do
mensageiro procurado. As sondas moleculares utilizadas na
hibridização podem ser cDNA, éxons, mas também os cosmídios
(ZHANG et al., 1992) ou mesmo os YAC inteiros (MARSHALL
et al., 1993). Nesse último caso, podemos determinar o número
de mensageiros presentes na região cromossômica estudada
e o tamanho deles. Tais mensageiros podem ser provenientes
de vários genes diferentes ou corresponderem a um único. A
detecção de vários mensageiros codiﬁcados por um mesmo gene
pode ter-se originado do fenômeno chamado recomposição
alternativa (splicing alternativo), dos sítios de poliadenilação
diferentes ou mesmo da utilização de diferentes promotores. A
técnica apresenta baixa sensibilidade, pois é muito dependente
45
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
do grau de expressão gênica. Entretanto, a utilização de RNA
poliadenilado, enriquecido em RNA mensageiros, permite o
aumento da sensibilidade.
A amplificação de éxons ou Exon trapping
A técnica de ampliﬁcação de éxons foi proposta por Duyk
em 1990 e Buckler em 1991. Ela foi aplicada com sucesso em
vários casos, por exemplo, no isolamento dos genes shaker-1
(GIBSON et al., 1995) e Bcg (VIDAL et al., 1993) nos camundongos
e do gene responsável pela Coréia de Huntington humana (The
Huntington’s Disease Collaborative Research Group, 1994). Essa
técnica permite isolar éxons presentes nos fragmentos de DNA
genômico clonados (cosmídio, YAC, BAC) graças à presença do
sítio doador e aceptor de splicing funcionais. O princípio do
exon trapping está ilustrado na Figura 22.
A ampliﬁcação dos éxons é independente do nível de
expressão dos genes procurados ou do tecido no qual eles são
expressos, uma vez que trabalhamos unicamente com material
genômico. A técnica é relativamente eﬁciente se não contarmos
com o problema do splicing críptico (splicing de seqüências
reconhecidas como éxons, mas que, na realidade, não o são).
Os genes que não possuem éxons, raros nos eucariotos, não
poderão ser isolados via tal método. Podemos citar o exemplo
do gene SRY, que possui um único éxon (GOODFELLOW;
LOVELL-BADGE, 1993).
Caso as seqüências isoladas não dêem resultados quando
da hibridização em Northern blot, uma RT-PCR baseada
na reação de transcrição inversa do RNA, seguida de uma
ampliﬁcação com oligonucleotídeos especíﬁcos para cada uma
das seqüências estudadas, permite veriﬁcar se estas são ou não
verdadeiros éxons (KAWASAKI, 1990).
A captura do DNA por afinidade ou DNA affinity capture ou
DNA selection
Técnica desenvolvida por Lovett e Parimoo em 1991
e, em seguida, adaptada por em Tagle 1993, permite isolar
46
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
os cDNA codiﬁcados por grandes fragmentos de DNA tais
como os YAC, cosmídios, BAC ou fagos. O método consiste na
hibridização do DNA genômico biotinilado (YAC, etc) com os
cDNA em solução. Em seguida, capturam-se os complexos DNA
genômico-cDNA com a ajuda de bilhas magnéticas cobertas de
estreptovidina (Figura 23). Construímos, assim, uma biblioteca
de cDNA enriquecida de seqüências codiﬁcadoras provenientes
do YAC ou cosmídio utilizado no início. O enriquecimento
pode ser aumentado em até 100.000 vezes, efetuando-se várias
rodadas sucessivas de seleção.
O sucesso dessa estratégia depende da relativa
abundância de cDNA na biblioteca utilizada para a seleção. A
técnica pode também conduzir ao isolamento de cDNA vindo
de outras regiões do genoma, caso exista um pseudogene no
fragmento de DNA genômico analisado. Outros problemas
podem ser encontrados e dizem respeito ao viés criado pela
PCR, que prefere a ampliﬁcação de fragmentos de pequenos
tamanhos (ou cDNA pequenos) e a diﬁculdade de eliminar
completamente as seqüências repetitivas do DNA genômico
inicial. Essas seqüências podem ser eliminadas pela desnaturação
e re-hibridização do DNA genômico inicial na presença de DNA
enriquecido em seqüências repetitivas. A diﬁculdade reside na
escolha do tempo ideal de incubação que permita a renaturação
unicamente das seqüências repetitivas, e não das seqüências
únicas. Se, após a incubação, ainda existir seqüência repetitiva
no DNA genômico, é possível que um cDNA contendo tais
seqüências seja isolado, pois esses elementos repetitivos
constituem uma certa proporção de cDNA (até 10%). Embora
apresente todas essas diﬁculdades, a técnica de captura de
cDNA contribuiu para a construção de mapas transcricionais de
várias regiões cromossômicas (KORN et al., 1992).
A sondagem de biblioteca de cDNA
A utilização de YAC inteiro para sondar bibliotecas de
cDNA foi descrita pela primeira vez por Wallace, em 1990,
47
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
quando da identiﬁcação do gene causador da neuroﬁbromatose
do tipo I. Em 1993, Geragthy e seus colaboradores, utilizando
essa mesma estratégia, isolaram seqüências de cDNA do
cromossomo X humano a partir de YAC de 480kb. Essa técnica,
mesmo permitindo isolar diretamente cDNA (em comparação
com aquela de captura e ampliﬁcação dos exons), apresenta
inúmeros inconvenientes: devido à complexidade da sonda,
as hibridizações inespecíﬁcas são comuns, o que diﬁculta o
reconhecimento dos sinais positivos; também é muito difícil
marcar um YAC inteiro com uma atividade especíﬁca durante um
tempo suﬁcientemente longo que permita sua recuperação após
hibridização. A taxa de falsos positivos é, portanto, muito alta
e está estimada em 40%. As seqüências repetitivas são difíceis
de ser eliminadas completamente da sonda e podem conduzir
ao isolamento de seqüências repetitivas transcritas(GERAGTHY
et al., 1993). Podemos concluir, então, que falta sensibilidade a
essa técnica.
A sondagem de bibliotecas de cDNA através dos cosmídios
inteiros oferece menos problemas, pois a sonda utilizada já não
é tão complexa (ZHANG et al., 1992). Enﬁm, qualquer que
seja a sonda utilizada, a eﬁciência da sondagem depende da
representação dos genes procurados e, conseqüentemente, do
grau de expressão destes.
Os métodos baseados na análise das ilhas CpG
As ilhas CpG (ou HTF para HpaII Tiny Fragments) são
deﬁnidas como segmentos de DNA de 500pb a 2Kb que têm
uma porcentagem de guanina + citosina (G+C) superior a 50% e
uma grande quantidade de duplos CpG não metilados, enquanto
que o restante do genoma é caracterizado por uma porcentagem
G+C menor (média de 40%) e pela metilação da citosina em 5’
da maior parte dos duplos CpG (LINDSAY e BIRD, 1987). Um
estudo publicado por Larsen em 1992 (LARSEN et al., 1992a)
mostrou que, entre 375 genes repertoriados no GenBank, todos
os genes com expressão constitutiva (housekeeping function)
e
em média 40% dos genes com expressão tissular especíﬁca
contêm uma ilha CpG. Essa ilhas, geralmente, cobrem a região do
48
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
promotor do gene e de 1 a 3 éxons. Raramente estão localizadas
na porção 3’ ou no interior mesmo das seqüências transcritas.
Num estudo similar, Antequera e Bird (1993) estimaram que dos
22.000 genes constitutivos, 55,9% dos genes humanos e 46,9%
dos genes de camundongos estão associados a essas ilhas
CpG e que mais de 40% dos 60.000 genes tecidos especíﬁcos
estariam no mesmo caso. Craig e Bickmore (1994) mostraram
que tais ilhas não estariam repartidas de maneira homogênea ao
longo do genoma, mas que estariam concentradas em domínios
cromossômicos particulares, no nível das bandas R, onde se
encontram os genes que são expressos.
Todos esses dados reunidos indicam que as ilhas CpG
são bons marcadores para se identiﬁcarem genes. Visto
que essas ilhas são formadas por uma alta densidade de
dinucleotídios CpG não metilados, elas podem ser detectadas
por enzimas de restrição sensíveis à metilação e que contenham
o dinucleotídio CpG nos seus sítios de reconhecimento. Na
Tabela 4 são mostradas as enzimas de restrição mais utilizadas
na detecção das ilhas CpG (de acordo com Bickmore e Bird,
1992). O grupamento de vários sítios reconhecidos por essas
enzimas numa curta região de DNA (alguns Kb) é um indicativo
da presença de uma ilha, que, na prática, é identiﬁcada pela
construção de um mapa de restrição da região estudada e
analisada pela eletroforese em campo pulsado. A presença de
uma ilha CpG próxima da sonda molecular é detectada pelo fato
de essa sonda reconhecer fragmentos de mesmo tamanho após
digestão do DNA genômico por diferentes enzimas de restrição,
em particular as citadas na Tabela 4. Duplas digestões utilizando
uma combinação dessas enzimas permitem conﬁrmar se tais
sítios estão agrupados no genoma (o tamanho dos fragmentos
detectados deve ser o mesmo para as digestões simples ou
duplas). A localização das ilhas CpG foi útil na clonagem do
gene brachyury (T) (HERRMANN et al., 1990) e na do gene da
ﬁbrose cística (CFTR) (ROMMENS et al., 1989). Essas ilhas podem
facilmente ser clonadas a partir de um YAC ou cosmídio (ELVIN
et al., 1992; VALDES et al., 1994) e utilizadas, em seguida, para
sondar bibliotecas de cDNA.
49
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
O sequenciamento genômico
Ao longo dos últimos anos, as técnicas de sequenciamento
foram consideravelmente melhoradas e, sobretudo,
automatizadas, graças ao desenvolvimento de seqüenciadores
automáticos (SMITH et al., 1986). Paralelamente a esse progresso,
os programas de comparação de seqüências e os que permitem
identiﬁcar seqüências codiﬁcadoras num segmento de DNA
anônimo também foram aperfeiçoados. Uberbacher e Mural
(1991) desenvolveram o programa GRAIL, que possibilita a
identiﬁcação de éxons a partir de uma seqüência de DNA com
uma ﬁdelidade de 80% e com baixa taxa de falsos positivos.
O programa BLAST (ALTSCHUL et al., 1990) permite comparar
rapidamente uma seqüência às bases de dados clássicas como,
por exemplo, GenBank, EMBL, etc. Os dados contidos em tais
bancos são cada vez mais numerosos, graças, principalmente,
ao Projeto Genoma Humano, que busca o sequenciamento da
totalidade do genoma, e também ao sequenciamento em larga
escala de cDNA (VENTER et al., 2001; LANDER et al., 2001).
Uma boa introdução a esses programas pode ser encontrada no
Guide to Human Genome Computing (1994). Uma ilustração
da utilização dessas técnicas é apresentada por Seto (1994) no
estudo dos receptores de linfócitos T humanos.
As outras técnicas
Citaremos a técnica desenvolvida por Lui e seus
colaboradores (1989) a qual permite isolar os genes humanos
transcritos numa linhagem celular híbrida hâmster-homem
(contendo um único cromossomo humano) e as técnicas
baseadas na recombinação homóloga entre o DNA analisado
e uma biblioteca de cDNA (KURNIT; SEED, 1990). Entretanto,
essas técnicas, relativamente fastidiosas, não obtiveram sucessos
em vários projetos de clonagem posicional.
O que nos aparece, em deﬁnitivo, é que a procura de éxons
e o sequenciamento direto são as duas técnicas mais utilizadas
na clonagem posicional de um gene; porém, logo que levamos
em conta as dimensões consideráveis do genoma humano ou
50
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
do camundongo, tais técnicas se tornam extremamente pesadas,
fastidiosas e, sobretudo longas. O ideal seria podermos dispor
de uma espécie relativamente próxima dos mamíferos, mas
que possuísse um genoma compacto, sem (ou com poucos e
pequenos) íntrons. A levedura (14Mb), a bactéria Escherichia
coli (4.7Mb) ou a drosóﬁla (165Mb) são espécies muito distantes
do ponto de vista ﬁlogenético para serem utilizadas, mesmo se
várias seqüências forem conservadas em todos esses genomas.
Entretanto, um genoma desse tipo existe no peixe tetrodontide
Fugu rubripes (BRENNER et al., 1993). O sequenciamento
sistemático dos 400Mb do genoma deste peixe mostrou que
90% deste correspondem a seqüências únicas e que seu
repertório em genes é muito análogo ao humano. Trower e seus
colaboradores, em 1996, encontraram uma conservação de
sintenia entre o genoma do Fugu e uma região do cromossomo
14 humano (14q24.3) que está associada à Doença de Alzheimer
(lócus AD3). O estudo do genoma do Fugu pode, então, ajudar
na clonagem posicional dos genes de mamíferos. A partir do
momento em que conhecemos um íntron procedente de um
“grande” genoma, poderemos utilizá-lo como sonda para a
clonagem das suas regiões vizinhas no Fugu e retornar, em
seguida, ao genoma estudado.
A identificação direta do cDNA candidato
Nestes últimos anos assistimos a uma revolução no
que diz respeito à genética humana: um consórcio de cinco
laboratórios ingleses, americanos e franceses (Génethon) que
interpuseram o mapeamento de dezenas de milhares de cDNA,
identiﬁcadas por sua etiquetas, às chamadas EST (Expressed
Sequence Tag). A primeira versão do Gene Map do genoma
humano que foi estabelecido pelo consórcio internacional das
EST apareceu em 1996 (SCHULER et al., 1996), incluindo mais
de 16.000 genes mapeados com relação a 1.000 marcadores
genéticos polimórﬁcos (Todos esses dados podem ser acessados
no endereço www.ncbi.nlm.nih.gov/SCIENCE96/).
O mapeamento dessas milhares de seqüências no
homem pode, evidentemente, servir à clonagem de mutações
51
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
nos camundongos, pois é sabido que 80% dos cromossomos
humanos têm uma homologia conhecida, com um segmento
cromossômico murino. O mapeamento preciso das EST no
homem oferece, levando-se em conta o jogo das homologias, um
grande número de candidaturas para os genes a serem clonados
no camundongo. É bem provável que essa estratégia seja muito
explorada para a clonagem das mutações dos camundongos
que tenham sido localizadas com precisão.
Isolamento de um mensageiro completo
A maior parte das técnicas descritas até agora não permite
isolar um mensageiro completo, e a solução mais evidente para
solucionar esse problema é buscá-lo em bibliotecas de cDNA.
Várias bibliotecas desse tipo estão disponíveis comercialmente
e, em geral, são de boa qualidade. Entretanto, o trabalho de
procura de uma seqüência completa de cDNA é muito cansativo
e necessita da presença de sondas de alta qualidade. A utilização
de sondas obtidas através da ampliﬁcação de éxons é delicada,
pois essas sondas são, geralmente, pequenas podendo gerar
muitos falsos positivos. A sondagem dessas bibliotecas pela
técnica de PCR (ALFANDARI; DARRIBÈRE, 1994; AMARACADI;
KING, 1994) é uma alternativa à sondagem por hibridização.
O isolamento da extremidade 5’ dos mensageiros pela
sondagem de bibliotecas de cDNA sempre causa problemas.
Tais
clones são, na realidade, muito pouco representados por causa
da diﬁculdade encontrada pela transcriptase reversa de copiar
na íntegra o mensageiro até 5’. Uma estratégia complementar à
sondagem de bibliotecas de cDNA é a técnica chamada RACE
(Rapid Ampliﬁcation of cDNA Ends, FROHMAN et al., 1988),
que ampliﬁca uma seqüência de RNA compreendida entre uma
pequena seqüência já conhecida (por exemplo, um éxon) e a
extremidade, seja 5’ ou 3’, do RNA correspondente. O princípio
da técnica de RACE está ilustrado na Figura 24. O RACE é
normalmente mais rápido que a sondagem de bibliotecas de
cDNA que podem necessitar de meses de trabalho antes que se
consiga isolar um mensageiro completo. Entretanto, a técnica do
52
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
RACE é pouco eﬁciente para se isolar a porção 5’ dos grandes
mensageiros.
A conexão entre éxons pela RT-PCR permite igualmente
isolar fragmentos de mensageiros sem ser preciso passar pela
sondagem de cDNA. Após a retro-transcrição do mRNA, o
cDNA é ampliﬁcado pelos oligonucleotídeos especíﬁcos dos
dois éxons conhecidos. Se eles pertencem ao mesmo transcrito
e se os oligonucleotídeos foram deﬁnidos na boa orientação,
todos os éxons localizados entre esses dois serão ampliﬁcados.
A identificação do bom candidato
Uma primeira seleção pode ser feita considerando-se
que o gene candidato deve apresentar um perﬁl de expressão
compatível com o fenótipo. Nós podemos efetivamente
pensar que um gene no qual o efeito esteja se manifestando
essencialmente no sistema nervoso central deva, a priori,
corresponder a um mensageiro transcrito principalmente no
cérebro. Entretanto, é preciso que seja identiﬁcada uma mutação
associada ao fenótipo na seqüência candidata. Uma deleção na
seqüência transcrita descoberta no animal mutante e ausente
no controle permite validar facilmente o gene em questão como
um bom candidato. Foi o que ocorreu com a clonagem do
gene Brachyury (HERRMANN et al., 1990) e com a do gene da
distroﬁna (MONACO et al., 1986). Infelizmente, as mutações
são, na maior parte das vezes, mais discretas e, portanto, mais
difíceis de ser detectadas. Pode agir-se, por exemplo, a partir
de mutações que afetem a recomposição dos éxons (detectável
pelo Northern blot), como para a β-talassemia (VIDAUD et
al., 1989), de mutações pontuais que levem à mudança de um
aminoácido por outro (mutação de sentido trocado), como,
por exemplo, no caso do gene Bcg (VIDAL et al., 1993), ou
ainda, como no caso da mutação spastic (spa), pode ocorrer
a intercalação de uma seqüência do tipo LINE dentro de um
íntron que altera o sítio de recomposição ou que crie outros
alternativos (KINGSMORE et al., 1994). Várias são as mutações
que só foram descobertas pelo seqüenciamento completo
53
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
do gene, caso em que a mutação se traduz pela substituição
de um aminoácido por outro. Aqui a questão é saber se essa
substituição é realmente responsável pelo fenótipo ou se não se
trata de apenas um polimorﬁsmo associado. As presunções são
um pouco reforçadas quando a versão normal do cromossomo
onde a mutação apareceu é acessível, pois, nesse caso, existe
uma referência precisa. As presunções são ainda mais reforçadas
se já existirem vários alelos mutantes e que cada um mostre
uma alteração diferente na seqüência. Foi assim que Balling e
colaboradores em 1996 mostraram que o lócus undulated (un -
Cromossomo 2), identiﬁcado por três alelos, era na realidade o
gene Pax1 (WALLIN et al., 1996).
Se o gene estudado só for conhecido por duas formas
alélicas, uma normal e outra patológica, a prova de que o
gene candidato isolado é o bom não pode ser obtida senão
por dois meios: reproduzindo-se a mutação pela inativação
do gene in vivo (camundongo Knock-out) ou, ao contrário,
corrigindo-se os efeitos da mutação nos camundongos pela
adição de um transgene correspondente a uma cópia normal
do gene (complementação transgênica). A construção desses
camundongos representa uma tarefa pesada, sobretudo quando
se trabalha com grandes genes (cf. FRAZER et al., 1995), e
raramente foi realizada na prática.
A clonagem posicional nos tempos atuais
Para aqueles organismos cujos genomas foram
seqüenciados, a clonagem posicional mudou muito. Porém, para
aqueles que ainda não possuem seus genomas completamente
seqüenciados e disponíveis, o princípio da clonagem posicional
permanece o mesmo.
Para os genomas seqüenciados, as mutações são
identiﬁcadas por uma combinação de mapeamento e
sequenciamento (Figura 25) (KILE & HILTON, 2005). Para o
mapeamento nada mudou, mesmo com o sequenciamento
completo do genoma murino. Assim, o objetivo principal desta
54
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
etapa continua sendo o de identiﬁcar marcadores polimórﬁcos
com localização cromossômica conhecida que estejam ligados
ao lócus responsável pelo fenótipo alterado estudado.
O mapeamento, assim como antes do sequenciamento,
pode ser dividido e dois grandes níveis: o mapeamento a baixa
resolução, no qual a mutação é localizada no interior de um
grande intervalo cromossômico; e o mapeamento de alta
resolução, onde o tamanho do intervalo é reduzido de forma
que o sequenciamento direto dos genes contidos neste intervalo
possa ser iniciado. O número de meioses, para ambos os níveis,
também não mudou, ou seja, para o mapeamento à baixa
resolução 20 a 100 animais são necessários para a genotipagem
com 40 a 100 marcadores distribuídos ao longo de todo o
genoma. Para o estágio seguinte, de 100 a 1000 meioses são
necessárias e analisá-se todos os marcadores polimórﬁcos
existentes no interior do intervalo cromossômico deﬁnido no 1º
nível do mapeamento.
Durante o processo de mapeamento, o intervalo
cromossômico candidato vai sendo deﬁnido e detalhado a
ponto de permitir o início de sequenciamento. Não existe
regras estritas que deﬁnem quando começar esta nova etapa
da clonagem. A decisão deve ser tomada levando-se em conta
vários fatores: o quão pequeno é o intervalo cromossômico e a
possibilidade de diminuí-lo ainda mais, possibilidade esta que
está vinculada a existência ou não de marcadores polimórﬁcos
na região; a densidade gênica na região, esta pode ser avaliada
diretamente no banco de dados do genoma murino (Ensembl:
http://www.ensembl.org/index.html); o custo e disponibilidade
para o sequenciamento comparado ao custo de se gerar e analisar
mais animais. Na prática, o reﬁnamento do intervalo genético
deﬁnido geralmente é acompanhado pelo sequenciamento.
Assim que a decisão de sequenciar é estabelecida,
a questão passa a ser “O que sequenciar?”. Levando-se em
conta que, a grande maioria das mutações pontuais clonadas
no camundongo, foram identiﬁcadas nas regiões codiﬁcadoras
55
O Princípio Geral da Clonagem Posicional
dos genes ou nas junções éxons-íntrons, certamente o início do
sequenciamento deve ser focado nessas regiões. A disponibilidade
da seqüência completa do genoma murino nos bancos de dados
facilita a identiﬁcação dos éxons dos diferentes genes contidos
no intervalo. Estes éxons podem ser ampliﬁcados e isolados
a partir do DNA genômico e sequenciados diretamente. Em
seguida, caso não seja encontrado mutações nessas regiões
prioritárias, deve-se pensar em sequenciar os íntrons, as regiões
3’ e 5’ não traduzidas, a região promotora e, por ﬁm, as regiões
intergênicas.
A escolha do gene a ser sequenciado deve ser sempre
combinada com o mapeamento à alta resolução. Por qual gene
começar é uma outra questão. Deve-se investigar detalhadamente
a mutação estudada do ponto de vista ﬁsiopatológico. A escolha
do gene candidato posicional pode ser influenciada pelos dados
clínicos da mutação como, por exemplo, processos bioquímicos
afetados, tecidos afetados, mutação com fenótipo
semelhante
existentes na mesma região cromossômica mapeada e as
homologias inter-espécies, principalmente entre o homem e o
camundongo.
A identiﬁcação da mutação ou do gene mutado no
intervalo cromossômico não signiﬁca, necessariamente, que esta
seja a mutação primária que levou a aparição da doença. Em
muitos casos, evidências indiretas são necessárias para provar
tal hipótese. Por exemplo, traçar um paralelo entre o fenótipo
observado quando o gene do camundongo está mutado e
os fenótipos quando o gene ortólogo está mutado em outros
organismos como no rato, homem, drosóﬁla, etc; ou mesmo a
similaridade fenotípica, no próprio camundongo, quando outros
genes cujas funções são conhecidas e que participam da mesma
via biológica do gene candidato em questão. Outra evidência
inclui o estudo da expressão ou atividade do gene mutado nos
tecidos afetados na patologia. Por outro lado, a evidência direta
da causa do fenótipo mutado é requerida. Assim podemos falar
da geração de animais mutantes transgênicos que recuperam o
fenótipo normal ou a geração de animais mutantes nocautes de
gene identiﬁcado.
56
ESTUDO DE CASO
Mapeamento genético do lócus pmn
Localização cromossômica da mutação pmn (BRUNIALTI et al.,
1995)
Um estudo recente utilizou metodologia da clonagem
posicional para o mapeamento genético do lócus pmn em
camundongos. Neste estudo 63 animais N2 homozigotos pmn/
pmn foram obtidos a partir das 12 fêmeas F1 interespecíﬁcas +/
pmn foram cruzadas com os machos +/pmn do estoque original,
tiveram seu DNA extraído de acordo com a metodologia de
AUSUBEL ET AL. (AUSUBEl et al., 1993) e forma analisados por
um painel de microssatélites.
Foram selecionados 37 marcadores moleculares do tipo
microssatélites distribuídos sobre a totalidade dos cromossomos
murinos e que revelaram um polimorﬁsmo entre as linhagens que
foram utilizadas no cruzamento interespecíﬁco (AITMAN et al.,
1991; CORNALL et al., 1991; DIETRICH et al., 1992; HEARNE et
al., 1991; LOVE et al., 1990; MONTAGUTELLI et al., 1991). Esses
marcadores foram utilizados na tipagem, pela PCR, dos 63 DNA
dos animais pmn/pmn, e a análise da segregação dos haplótipos
foi realizada através do programa GeneLink (Montagutelli et al.,
1990). Desse modo, foi observado observar um desequilíbrio de
ligação entre o lócus pmn e vários marcadores situados sobre
o cromossomo 13 de camundongo (D13Mit80, D13Mit215,
D13Mit115, D13Mit3, D13Mit16, D13Mit154 e D13Mit61). Os
marcadores mais próximos do lócus pmn foram D13Mit215 e
D13Mit115. A ordem mais provável desses loci do cromossomo
13 é: D13Mit80, D13Mit215, pmn, D13Mit115, D13Mit3,
D13Mit16, D13Mit154 e D13Mit61.Uma análise detalhada dos
haplótipos está apresentada na Figura 26.
Para conﬁrmar essa localização cromossômica do lócus
pmn, dois outros cruzamentos foram estabelecidos utilizando
marcadores fenotípicos facilmente reconhecidos (Figura 27).
57
Estudo de Caso
Foram construídos dois estoques balanceados Xt +/+ pmn
e pe +/+ pmn cujos resultados foram:
de 641 animais nascidos do cruzamento entre animais •
do tipo Xt +/+ pmn (o que representa 1.282 meioses) não foi
encontrado nenhum recombinante (Figura 27). Nessas condições
estimou-se que a distância genética máxima entre o lócus pmn
e os marcadores Extra-toe (Xt) é certamente inferior a 1 cM, com
um risco de 5%. A mutação Extra-toe equivale a uma deleção
da região 5’ do gene Gli3 (zinc ﬁnger gene Gli3) (VORTKAMP
et al., 1992) e, no homem, corresponde à síndrome de Greig
cefalopolisindactilia. O estoque balanceado Xt +/+pmn é de
extrema importância, pois permite diagnosticar o fenótipo do
animal desde o nascimento. Observando-se minuciosamente
os recém-nascidos, é possível distinguir os camundongos que
irão desenvolver o fenótipo pmn daqueles que permanecerão
normais: estes possuem um dedo extranumerário sendo do tipo
Extra-toe (Xt/+) (Figura 28);
dos 212 animais produzidos a partir do cruzamento •
entre os animais pe +/+ pmn (424 meioses) foram encontrados
10 recombinantes, ou seja, animais do tipo pe pmn/pe pmn
que apresentam, ao mesmo tempo, os fenótipos pmn e uma
coloração clara da pelagem. Esse resultado colocou pmn a 42
cM do lócus pe.
O próximo passo, seguindo a estratégia da clonagem
posicional, foi o de densiﬁcar o mapa genético vizinho ao lócus
pmn. Densiﬁcar o mapa genético consiste na localização do
maior número possível de marcadores genéticos vizinhos ao
lócus pmn e, para que essas distâncias genéticas possam ser
calculadas com grande precisão, é preciso analisar o maior
número possível de meioses.
Para tanto, um conjunto de DNA originados do
retrocruzamento chamado EUCIB, implicando as linhagens
de camundongos C57BL/6 e SEG/Pas (BREEN et al., 1994), foi
utilizado. Através deste painel de DNA foi possível localizar com
precisão o gene Gli3 utilizando-se para este ﬁm o fragmento
58
Estudo de Caso
molecular do gene Gli3, chamado Gli20 (VORTKAMP et
al., 1992), o qual revelou-se polimórﬁco (RFLP) entre as duas
linhagens utilizadas no EUCIB. Com este mesmo painel de
DNA procedeu-se a localização de 30 marcadores existentes
no cromossomo 13 na região de mapeamento do lócus pmn
(Figura 29).
Mapa genético humano
Da comparação do mapa genético humano com o dos
camundongos observa-se grupos de homologia de sintenia
entre o cromossomo 13 animal e os cromossomos 1, 3, 5, 6, 7,
9 e 10 humanos (Figura 17).
A mutação pmn foi descrita como o modelo animal da
amiotroﬁa espinal do tipo I (Werdnig-Hoffmann), a expressão
aguda da SMA (SCHMALBRUCH et al., 1991) e que foi localizada
no cromossomo 5q11.2-q13.3 humano (BRZUSTOWICZ et al.,
1990; MELKI et al., 1990). Com o intuito de conﬁrmar tal hipótese
foi isolado um fragmento de DNA animal possuindo 95% de
homologia com o gene humano causador da SMA e chamado
SMN (Survival Motor Neuron) (LEFEBVRE et al., 1995; VIOLLET
et al., 1997). Através desse fragmento realizou-se a SSCP com
os DNA dos animais pmn/pmn do primeiro cruzamento, tendo
encontrado 11 recombinantes sobre 55 animais testados. Esse
resultado separou o lócus pmn do lócus Smn de 20 cM e colocou
este numa região mais distal, homóloga à região 5q13 humana.
Conclui-se que pmn não era o modelo animal de SMA, pois este
recombina com o lócus Smn causador da doença.
A Figura 30 representa o mapa genético da região
cromossômica contendo pmn, no qual observa-se que pmn
está localizado numa região cromossômica compreendida entre
0 a 1 cM (intervalo de conﬁança de 95%) do lócus Xt (Gli3).
Tais distâncias são compatíveis com a construção de um contig
cobrindo a região.
Construção de um contig contendo o lócus pmn
Dando prosseguimento à clonagem posicional do
lócus pmn, a etapa seguinte consistiu no isolamento da região
59
Estudo de Caso
cromossômica contendo o lócus pmn na forma de um conjunto
de clones contíguos também chamado do contig.
Num primeiro momento os cromossomos artiﬁciais de
levedura (YAC) foram utilizados, estes podem conter grandes
fragmentos clonados (de mais de centenas de Kb). O mapa
genético da região onde se localiza pmn indicava cinco
marcadores particularmente interessantes: os microssatélites
D13Mit215, D13Mit305 e D13Mit115 e as sondas moleculares
Gli11 e Gli20, que correspondem respectivamente às
extremidades 5’ e 3’ do gene Gli3 (Xt). Esses marcadores foram
usados na seleção dos YAC.
Mais adiante, também foi estabelecido o contig de
cromossomos artiﬁciais de bactérias (BAC).
Isolamento e caracterização preliminar dos YAC que contêm
D13Mit215, D13Mit305, D13Mit115, Gli11 e Gli20
Os YAC selecionados a partir dos marcadores Gli11 e
Gli20 foram isolados da biblioteca do Imperial Câncer Research
Fund; os selecionados a partir dos outros marcadores foram
isolados no Généthon, que possui as bibliotecas oriundas do
MIT/ Princeton (KUSUMI et al., 1993), que cobre 4 vezes o
genoma animal; ICFR (LARIN et al., 1991), que cobre 3 vezes o
genoma de camundongos; St. Mary’s Hospital (CHARTIER et al.,
1992), que cobre 3,5 vezes o genoma de camundongos.
Essas bibliotecas estão organizadas em pools e superpools
de YAC, podendo ser explorados pela PCR. Desse trabalho foi
possível isolar 28 clones.
Para a determinação do tamanho dos fragmentos contidos
em cada YAC isolado o DNA de alto peso molecular desses
clones foi preparado em blocos de agarose e os cromossomos
de levedura foram separados pela eletroforese em campo
pulsado. O DNA, assim preparado, foi transferido sobre uma
membrana de Nylon N+ e hibridizado com uma sonda radioativa
correspondente ao gene URA3 da levedura. O tamanho dos
60
Estudo de Caso
fragmentos dos YAC foi determinado pela comparação com
os tamanhos dos cromossomos endógenos de levedura. (Um
exemplo de hibridização pode ser visto na Figura 31 e na
Tabela 5 estão representados os resultados obtidos.) Essa etapa
possibilitou a veriﬁcação de quais clones eram estáveis, ou seja,
aqueles que nos deram como resultado da hibridização duas
bandas, uma que corresponde ao gene URA3 endógeno, e
outra correspondente ao YAC. Da mesma forma, foi testada a
presença dos marcadores D13Mit215, D13Mit305 e D13Mit115,
utilizamos o método da PCR com uma alíquota de cada cultura
diluída 100 vezes. Já para os clones isolados a partir das sondas
moleculares Gli11 e Gli20 uma membrana foi preparada e
hibridizada com essas sondas.
Dentre os clones estáveis, foram identiﬁcados aqueles
que continham ao menos dois marcadores que serviram no
isolamento destes e foi estado a presença de todos os marcadores
microssatélites que haviam sido mapeado na região do lócus
pmn.
Os marcadores INHBA (PANG et al., 1992) e GCK para o
gene da glucocinase (SANTOSH et al., 1992), que correspondem
aos iniciadores que ampliﬁcam o DNA humano e que estão
localizados no cromossomo 7 humano (na região homóloga ao
cromossomo 13 animal, ao redor do lócus pmn), também foram
utilizados nessa etapa da clonagem posicional. Os resultados
dessa etapa estão representados na Figura 32.
Dessa fase clonclui-se que o YAC Y902.2 revelou ser
o clone mais interessante, pois ele continha três marcadores
moleculares - Gli11, Gli20 e GCK - e sabendo-se que pmn está
a uma distância inferior a 1 cM (risco de 5%) do lócus Xt (gene
Gli3), o que representa, em média, 1.800 Kb.
Isolamento e caracterização preliminar dos BAC contendo os
marcadores D13Mit215, Gli11, Gli20 e D13Mit115
Esses marcadores serviram no isolamento dos BAC
de uma biblioteca construída a partir do DNA genômico de
61
Estudo de Caso
camundongo. Desde processo resultou o isolamento de 3 BAC
a partir do marcador Gli11, 7 clones com o marcador Gli20, um
único com o marcador D13Mit215 e um outro com o marcador
D13Mit115.
O DNA desses clones foi extraído de acordo com o
protocolo estabelecido no Research Genetics (descrito em
Material e Métodos), em seguida, foi veriﬁcada a presença dos
marcadores que foram utilizados para o isolamento através de
hibridizações com os marcadores Gli11 e Gli20 e pela PCR com
os demais marcadores. Esses clones foram utilizados na procura
de seqüências codiﬁcadoras que se encontram nessa região
(Tabela 6).
Mapa físico ao redor do lócus pmn
A etapa seguinte da clonagem posicional consiste na
construção de um mapa de restrição do contig, que deve
evidenciar possíveis rearranjos ocorridos com os insertos
contidos nos YAC (inserções, deleções), permitindo localizar
os genes candidatos na região de interesse. Ela também serve
como referência para a construção do mapa físico da região
genômica correspondente.
Esse mapa foi construído com 3 YAC – Y902.2, Y903.1
e Y13.305.2 –, permitindo a detecção de todos os rearranjos
neles existentes, sendo que seria pouco provável que três clones
independentes apresentassem as mesmas anomalias.
As enzimas de restrição que cortam raramente o genoma
e que estão associadas às ilhas CpG (veja explicação na
Introdução) foram utilizadas na construção de tal mapa. Todos
os sítios de restrição foram identiﬁcados para as enzimas BssHII,
EagI, MluI, NotI, NruI, SacII e SmaI.
Foram realizadas digestões parciais pelas enzimas citadas
acima com o DNA do YAC preparados em blocos de agarose.
Os fragmentos foram, em seguida, separados por eletroforese
62
Estudo de Caso
em campo pulsado. O DNA foi transferido para uma membrana
de Nylon N+ e esta foi hibridizada sucessivamente com:
1. um fragmento do pBR322, que corresponde ao •
braço direito do pYAC4;
2. um fragmento do pBR322, correspondendo ao •
braço do pYAC4.
Tal procedimento permitiu determinar a posição de cada
sítio de restrição com relação à extremidade direita ou esquerda
do vetor pYAC4 (método adaptado de SMITH; BIRNSTEIL,
1976).
A extremidade esquerda do inserto contido no clone
Y202.2 foi isolado através da técnica de PCR inversa RsaI.
O fragmento de 500 pb foi seqüenciado e denominado
“extremidade 11”, este foi utilizado na construção do mapa de
restrição do contig. Esse fragmento, presente nos YAC Y902.2,
Y903.1 e Y13.305.2 (Figura 33), corresponde a uma EST de
camundongo isolada de uma biblioteca de cDNA construída a
partir de um tecido de coração hipertroﬁado.
Os fragmentos de DNA Gli20 e Gli11, que correspondem
ao gene Gli3, foram igualmente utilizados na construção
do mapa de restrição do contig e suas localizações foram
determinadas através de hibridizações sobre as membranas de
nylon construídas para este ﬁm. A comparação do resultado de
hibridização para cada um dos fragmentos permitiu a localização
precisa dos marcadores e conduziu ao estabelecimento do mapa
de restrição do contig, representado na Figura 34.
As porções quiméricas dos YAC puderam ser determinadas
através da comparação entre os mapas de restrição estabelecidos
para cada clone. Por exemplo: o YAC Y301.1 é quimérico;
através do mapa de restrição desse clone identiﬁcou-se todos
os sítios de restrição comuns com os clones Y902.2 e Y13.305.2
e que não são quiméricos.
63
Estudo de Caso
Esse contig cobre uma distância de aproximadamente
2 Mb entre a extremidade proximal do clone Y902.2 e distal
do clone Y13.305.2. Nenhum rearranjo ou deleção maior
foi observado no YAC Y902.2. Se nenhum recombinante foi
encontrado entre pmn e Xt (gene Gli3) chegou-se a conclusão
que o YAC 902.2 representava o principal clone para a procura
de seqüências codiﬁcadoras existentes nessa região.
O resultado deste trabalho foi a identiﬁcação de pelo
menos três ilhas CpG potenciais presentes nesses clones: 2
ilhas nos YAC Y902.2 e Y13.305.2, entretanto não foi possível
determinar se esses sítios são metilados in vivo nos camundongos.
O status dessas ilhas CpG deveria, então, ser conﬁrmado pelo
mapeamento da região genômica correspondente. Entretanto,
Larsen e outros (1992b) mostraram que, desde que 3 ou
mais sítios dessas enzimas que cortam raramente o genoma
coincidam com o nível do DNA do YAC, esses sítios devem
estar associados aos genes ao menos em 90% dos casos.
Isolamento e caracterização dos éxons a partir do DNA do
contig
Com o objetivo de identiﬁcar as seqüências codiﬁcadoras
a partir do contig foi utilizada a técnica de ampliﬁcação dos
éxons, sendo que, contig de BAC estabelecido na região de
interesse foi o escolhido para este ﬁm.
Os experimentos foram realizados com os BAC isolados
a partir dos marcadores moleculares Gli20, Gli11, D13Mit215 e
D13Mit115, respectivamente os clones 283E20, 12P11, 388A11
e 496K2 (Tabela 6).
Na primeira etapa, após clonagem no vetor pAMP10,
foram eleiminados os clones que continham insertos muito
pequenos (< 100 pb), pois seria muito complicado escolher
iniciadores
para a PCR a partir de fragmentos de pequeno
tamanho.
64
Estudo de Caso
Não foi possível isolar seqüências codiﬁcadoras a partir
dos clones 388A11 e 496K2. Os resultados apresentados
correspondem, pois, aos insertos isolados a partir dos clones
283E20 e do clone 12P11.
Foram obtidas 115 colônias; destas, 47 foram eliminadas,
pois continham insertos de tamanho inferior a 100 pb; 50
colônias continham apenas as seqüências do vetor. Na verdade,
como foi descrito na seção Material e Método, o DNA genômico
a ser analisado é clonado dentro de um íntron do gene tat de
HIV. A presença de um sítio crítico de recomposição dentro
desse íntron pode, em parte, ser o responsável pelo isolamento
dos falsos positivos contendo seqüências derivadas do vetor.
Enﬁm, 10 colônias, correspondentes às seqüências provenientes
dos marcadores Gli11 e Gli20, foram isoladas.
A Tabela 7 e a Figura 35 indicam os resultados das 8
colônias restantes nas quais as seqüências correspondem às
seqüências de genes conhecidos ou não e às seqüências das
EST humanas.
No total, foi possível explorar 260Kb, nas quais foram
encontrados 8 fragmentos correspondentes a 8 genes potenciais.
Dessa forma, estimou-se que na região do cromossomo 13 de
camundongos contendo o lócus pmn, a densidade gênica média
deve ser de um gene a cada 33 Kb.
As EST
As EST humanas, das quais o mapeamento cromossômico
foi publicado (SCHULER et al., 1996), oferecem uma ferramenta
na clonagem dos genes de camundongos levando-se em conta as
homologias de sintenia conhecidas entre essas duas espécies.
Neste sentido, foram selecionadas as EST humanas
localizadas na região 7p vizinhas ao gene Gli3 e, dessa primeira
seleção, priorizou-se aquelas EST que não tinham homologia de
seqüência com um gene já conhecido.
65
Estudo de Caso
Assim, 15 dessas EST (Tabela 8) e seus iniciadores foram
testados pela PCR sobre o DNA de todos os nossos clones YAC
e BAC (Figura 35), sobre o DNA genômico e cDNA (RT-PCR do
fígado) dos animais de fenótipo pmn, Xt e selvagem (+), o que
permitiu o reconhecimento da existência de uma ou mais EST
localizadas nessa região do cromossomo 13 de camundongos
e, através da técnica da RT-PCR foi possível evidenciar uma
possível diferença de ampliﬁcação entre três cDNA testados
(Xt, pmn e selvagem). O DNA genômico serviu como controle
da ampliﬁcação. A Tabela 8 mostra a totalidade dos resultados
obtidos.
Ainda que a maior parte das EST testadas nos tenha dado
resultados positivos para a RT-PCR, nenhuma delas permitiu
detectar uma diferença no tamanho do produto ampliﬁcado
pela PCR entre os animais Xt, pmn ou selvagem (um exemplo
disso está mostrado na Figura 36). Tal aﬁrmação mostra o poder
dessa ferramenta na clonagem dos genes murinos.
66
A MUTAÇÃO pmn: UM MODELO DE NEUROPATIA
HUMANA
pmn: um modelo potencial para a patologia neuromuscular
humana
pmn: uma mutação de efeitos independentes
O estudo de caso apresentado ilustrou a tentativa de
clonagem posicional de um gene responsável pela mutação de
camundongos cujos efeitos são principalmente neuropatológicos,
os quais podem ser observados no nível dos neurônios motores
na medula espinal. Essa neuropatia é causada por um processo
de “morte retrógrada” (dying back neuronopathy), durante o
qual a patologia começa nas terminações nervosas e progride
ao longo do axônio em direção ao corpo celular. Esse esquema
patológico já é conhecido no homem e pode ser encontrado nas
diversas formas de amiotroﬁas espinais. A mutação descrita tem
penetrância completa, pois aparece em 100% dos indivíduos
homozigotos, e o desenvolvimento da doença é totalmente
homogêneo em relação ao tempo e à gravidade qualquer que
tenha sido a linhagem de camundongo na qual a mutação
tenha segregado. Essa aﬁrmação é extremamente interessante,
pois, contrariamente a outras mutações neurológicas dos
camundongos como, por exemplo, wobbler (wr - crom. 11 -
DESPORTES et al., 1994), ela mostra que o processo patológico
que leva os animais pmn/pmn a morte é sem dúvida alguma
controlado pelo único gene pmn.
pmn não é o lócus homólogo ao lócus responsável pela amiotro-
fia espinal do tipo Werdnig Hoffmann humana
Ao longo do trabalho também foi mostrado que, a
despeito de fortes semelhanças anatomopatológicas, a mutação
pmn não correspondia ao homólogo murino da amiotroﬁa
espinal do tipo Werdnig Hoffmann humana. Este gene (Smn),
que agora está clonado, foi mapeado a, mais ou menos, 20
cM do lócus pmn na região telomérica do cromossomo 13 de
A Mutação pmn: Um Modelo de Neuropatia Humana
67
camundongos, exatamente no ponto em que não era esperado,
ou seja, na região de homologia com o cromossomo 5 (5q11.2-
q13.3), onde o gene humano SMN foi mapeado.
Até o presente momento não existe nenhum alelo
mutante espontâneo do lócus Smn e espera-se que esta seja
produzida in vitro, por recombinação homóloga nas células
ES, quando, então, talvez seja revelada a função desse gene
nos camundongos. Poder-se-á, dessa forma, medir o quão as
síndromes humanas podem ser semelhantes umas às outras.
Essa ausência de homologia entre pmn e Smn não
representa um caso isolado. Ao olharmos as Tabelas 1 e 2
percebemos que grande parte dos genes recuperados nos
camundongos e que têm efeitos deletérios sobre o sistema
neuromuscular não possuem homólogos conhecidos na espécie
humana, e vice-versa. Assim, podemos dizer que nesse estudo
de caso o homólogo humano da “síndrome” pmn ainda não é
conhecido.
Talvez a hipótese mais plausível para explicar tal
observação, seja o fato de que dispomos, até o presente momento,
de somente uma pequena amostra dos mutantes potenciais de
camundongos. Nesse contexto, os grandes projetos mundiais
de indução de novas mutações através de agentes químicos,
como o Etil-nitroso-uréia (ENU), abrem sem dúvida algumas
perspectivas muito interessantes.
pmn: um bom modelo análogo às amiotrofias espinais
Outro fato relatado neste estudo de caso e que vale
a pena salientar foi o sistema de manutenção da mutação
desenvolvido. Este consistiu no cruzamento dos indivíduos
duplos heterozigoto Xt e pmn entre eles (Xt +/ + pmn), o qual
possibilita o reconhecimento, desde o nascimento, dos animais
que desenvolverão a doença pmn antes mesmo que os primeiros
sinais da patologia apareçam. Tal modelo de manutenção permitiu
que a mutação pmn fosse utilizada para testar a eﬁciência de
A Mutação pmn: Um Modelo de Neuropatia Humana
68
certas estratégias terapêuticas através de substâncias biológicas
ou químicas conhecidas por suas atividades na sobrevivência
dos neurônios motores. Foi demonstrado, por exemplo, que a
administração do CNTF (Ciliary Neurotrophic Factor), sintetizado
por ﬁbroblastos geneticamente modiﬁcados e enxertados no
começo da doença, diminui a velocidade da evolução da doença,
mas não consegue pará-la deﬁnitivamente (SAGOT et al., 1995b;
SENDTNER et al., 1992). Da mesma forma, foi demonstrado que
a superexpressão do proto-oncogene Bcl-2 (que secreta uma
substância anti-apoptótica) nos homozigotos pmn/pmn não age
na progressão, tão pouco na expressão da doença e também
não impede a degeneração axonal. Entretanto, foi estabelecido
que ela reduz a perda neural no núcleo facial (SAGOT et al.,
1995a). Enﬁm, a administração do fator neurotróﬁco GDNF
(Glial cell line Derived Neurotrophic Factor) produz resultados
similares ao CNTF (SAGOT et al., 1996).
Esses resultados levam-nos a pensar que, para essa
mutação, o processo patológico fundamental não é um problema
do corpo celular, mas, ao contrário: que ela leva a uma neuropatia
secundária, e não a uma axonopatia. Além disso, esses estudos
mostraram que (1) os mecanismos que levam a uma axonopatia
são independentes daqueles que causam as neuropatias e (2)
que os fatores neurotróﬁcos
têm mecanismos de ação muito
especíﬁcos e que são diferentes uns dos outros.
pmn, onde está o mal?
O estudo anatomopatológico dos camundongos
homozigotos para a mutação pmn mostrou claramente
que somente uma parte dos neurônios motores é afetada
e degenera, enquanto que a outra parte, aparentemente,
sobrevive normalmente. As razões dessa heterogeneidade
não são conhecidas, mas, com certeza, a elucidação dessa
diferença poderá ser de grande importância na compreensão da
ﬁsiopatologia da doença. Poderíamos imaginar que a população
de neurônios motores, como a população de linfócitos, ainda
que homogêneos do ponto de vista morfológico, na realidade
é composta de várias famílias, cada uma respondendo a fatores
A Mutação pmn: Um Modelo de Neuropatia Humana
69
tróﬁcos diferentes. Nesse caso, pmn afetaria somente uma única
subpopulação de neurônios motores. Contrariamente, também
poderíamos pensar que todos os neurônios motores pertencem
a uma mesma família e que a degeneração de alguns deles nos
animais pmn, num estado precoce, seria apenas o resultado
de um evento já programado, mas que nesses animais estaria
acontecendo prematuramente.
Alguns trabalhos realizados com os fatores de crescimento
dos neurônios motores (HENDERSON, 1995) tendem a aceitar a
hipótese da existência de uma heterogeneidade populacional.
A etapa seguinte
A despeito dos esforços realizados, não foi possível
identiﬁcar genes candidatos para o lócus pmn, mas, graças ao
contig de YAC e BAC construído, sabe-se que o gene está mega
pares de bases que foram clonados. Várias estratégias poderão
ser seguidas na continuação deste trabalho, quais sejam:
realização um enorme trabalho de subclonagem dos •
clones do contig e, em seguida, um sequenciamento sistemático,
como vem sendo feito classicamente no homem;
recuperação dos cDNA candidatos através da •
hibridização in situ ou a cDNA selection, mas, como já foi
dito anteriormente, esta é uma técnica difícil de se colocar em
prática;
na realidade, tendo em vista o atual estado dos •
conhecimentos e dos meios disponíveis, o mais astucioso e o
menos oneroso consiste, sem dúvida alguma, em utilizar as EST
já mapeadas na região homóloga humana, que estejam sobre
o cromossomo 13 murino e que etiquetem um novo gene.
Entretanto, certamente serão encontrados novos marcadores
moleculares que permitirão melhorar a resolução do nosso
mapa físico.
Uma conclusão tirada da clonagem posicional é que,
contrariamente ao que a maioria acredita, ela é, na prática, mais
A Mutação pmn: Um Modelo de Neuropatia Humana
70
difícil de ser concluída nos camundongos do que no homem.
No caso descrito, chegou-se muito perto do lócus pmn, já que
foi possível criar a quantidade de animais desejados e realizar,
dessa forma, um mapa muito preciso em volta do lócus pmn.
Entretanto, existe apenas um único alelo mutante para ser
comparado ao alelo normal e, caso esta seja uma mutação de
ponto, o seqüenciamento de todo o gene deve ser considerado
um fato para, quem sabe, identiﬁcar a anomalia. Em humanos,
ao contrário, os genes que foram clonados o foram porque
existia, na maior parte das vezes, uma grande variedade de
alelos (os geneticistas humanos falam de famílias), os quais
às vezes estavam associados a rearranjos cromossômicos
mais ou menos importantes (translocações, inversões, etc.), e
sabemos que esses rearranjos são tidos como marcadores de
proximidade e ajudam muito no trabalho dos pesquisadores.
Nos camundongos, podemos encontrar rapidamente a ordem
linear dos genes dentro de um segmento cromossômico, mas
eles não permitem identiﬁcar facilmente um gene que só possui
um único alelo mutante.
O fato de que o lócus pmn não recombina jamais com
o lócus Xt pode, de certa forma, confundi as idéias, pois é
exatamente o que esperado na medida em que o marcador Xt
representa uma pequena deleção. Espera-se colocar no futuro o
lócus pmn na frente de um segundo alelo Xt (Pdn, por exemplo),
o qual não possui uma deleção, mas corresponde a um pequeno
rearranjo cromossômico. Além disso deve-se pensar em refazer o
mapa genético da região a partir de um cruzamento envolvendo
um cromossomo normal, pertencente a uma outra linhagem de
camundongo, e que possua vários marcadores que estejam em
repulsão com relação a pmn.
Podemos definir o perfil de um gene candidato?
Atualmente, várias mutações que levam a morte dos
neurônios motores foram identiﬁcadas pela clonagem posicional
humana ou nos camundongos ou, o que é mais freqüente, pelo
knock-out de um gene cuja função era total ou parcialmente
desconhecida. Os resultados obtidos não permitem deﬁnir um
A Mutação pmn: Um Modelo de Neuropatia Humana
71
perﬁl de uma proteína candidata para o produto do gene pmn.
Genes tão diferentes como Sod1 (Superoxyde
dismutase), Il3 (Interleukina 3) ou Nfh (Neuroﬁlament heavy
protein) conduzem todos os três a uma amiotroﬁa espinal com
comprometimento dos neurônios motores e suas seqüências
nucleotídicas não têm nenhuma homologia.
Nesse ponto admiti-se ainda que os genes que codiﬁcam
proteínas que têm receptores na superfície das células-alvo
produzirão o mesmo tipo de mutação que os genes que
codiﬁcam para o ligante. Infelizmente, pouquíssimas são as
mutações nos camundongos que afetem principalmente o
neurônio motor (conhecemos oito mutantes desse tipo). Além
disso, para nenhuma delas o gene está clonado ou possui um
equivalente conhecido no homem (BRUNIALTI et al., 1995), o
que quer dizer que, no ﬁnal, ao menos oito novas proteínas serão
descobertas, todas com um papel importante na manutenção da
integridade do neurônio motor... certamente deve existir muito
mais que isso!
72
FINAL DA HISTÓRIA
O gene responsável pela mutação pmn foi ﬁnalmente
clonado em 2001 (MARTIN et al., 2002). Para tanto, foi necessário
analisar 902 animais F2 mutantes, ou seja, 1804 meioses para,
assim, obter-se um mapeamento genético e físico à alta resolução
(MARTIN et al, 2001). Um BAC foi isolado contendo o lócus
pmn, o qual foi, então, totalmente seqüenciado, sendo possível
evidenciar o gene Tbce (tubulin-specific chaperone e) como um
forte candidato para a mutação pmn. Após análises de expressão
e seqüenciamento do gene nos animais normais e mutantes foi
identiﬁcado que a mutação levando ao fenótipo pmn era uma
substituição de um aminoácido triptofano para uma glicina na
posição 524 (Trp524Gly), correspondendo ao último aminoácido
da proteína “chaperone e tubulina-especíﬁca” (Tbce). Essa
substituição levou à queda na estabilidade da proteína. Foi
levantada a hipótese de que, em camundongos, a proteína Tbce
teria um papel fundamental na manutenção da integridade
celular dos neurônios motores, provavelmente agindo sobre
a estabilidade ou sobre a dinâmica de polimerização destes.
Finalmente, o gene Tbce murino tem seu ortólogo humano TBCE
localizado no cromossomo 1. No homem, uma mutação nesse
gene causa a Síndrome Kenny-Caffey (PARVARI et al., 2002),
cujo fenótipo é totalmente diferente daquele observado nos
animais pmn. Essa constatação pode signiﬁcar que a proteína
codiﬁcada pelo gene TBCE esteja atuando em diversos tecidos
e que mutações diferentes podem ter conseqüências distintas
levando a diferentes fenótipos.

73
MATERIAL E MÉTODOS UTILIZADOS NO ESTUDO DA
MUTAÇÃO pmn
Origem dos alelos mutantes e das linhagens utilizadas
O alelo mutante pmn utilizado no estudo de caso
apresentado foi importado do Instituto Panum, em Copenhague,
onde foi descoberto num estoque de camundongos da
linhagem NMRI/Pan (SCHAMALBRUCH et al., 1991). Machos
heterozigotos +/pmn oriundos do estoque de origem foram
retrocruzados inúmeras vezes com fêmeas da linhagem 129/
Sv-Pas, que corresponde a uma linhagem isogênica mantida
no Instituto Pasteur, na
França com o objetivo de aumentar o
proliﬁcidade dos animais mutantes.
Os alelos mutantes Extra-toes (Xt) e pearl (pe) foram
importados do Mammalian Genetic Unit, do M.R.C., Harwell,
UK (cortesia dos doutores A. G. Searle e M. F. Lyon). Esses alelos
também foram transmitidos para o background genético do tipo
129/Sv-Pas, da mesma forma como foi feito para o alelo mutante
pmn.
A mutação Extra-toe (Xt) é autossômica dominante e
caracteriza-se, do ponto de vista fenotípico, pela presença de
um dedo extra-numerário na face interna das patas posteriores
(Figura 28). A mutação pearl (pe) é autossômica recessiva e
caracteriza-se por uma forte diluição da coloração da pelagem
que pode ser mais bem observada em animais cujo background
genético é Agouti-Black (A/-; B/-).
Para o estabelecimento da localização genética da
mutação pmn foi utilizado camundongos da linhagem SEG/
Pas e STF/Pas, linhagens parcialmente isogênicas derivadas da
espécie Mus spretus.
74
Material e Métodos Utilizados no Estudo da Mutação pmn
Protocolos experimentais utilizados no estabelecimento do
mapa genético
Cruzamentos realizados
Para realizar o mapeamento genético da mutação pmn,
foram realizados dois tipos de cruzamentos.
O primeiro cruzamento foi do tipo retrocruzamento •
interespecíﬁco implicando as linhagens SEG/Pas e STF/Pas, as
quais correspondem às linhagens moderadamente isogênicas
provenientes da espécie Mus spretus. Esse retrocruzamento
interespecíﬁco foi construído para o mapeamento do lócus
pmn através da utilização de marcadores moleculares do tipo
microssatélites, que são muito polimórﬁcos entre as linhagens
derivadas das espécies Mus spretus e as linhagens de laboratório.
Além disso, os microssatélites são facilmente utilizáveis,
permitindo assim localizar o lócus pmn relativamente rápido.
Várias fêmeas heterozigotas +/pmn foram cruzadas com
machos +/+ STF/Pas ou SEG/Pas para a produção de fêmeas F1 +/
pmn? (os machos F1 oriundos desse cruzamento são estéreis). As
fêmeas F1 interespecíﬁcas foram retrocruzadas com os machos
+/pmn do estoque de origem. Os animais mutantes pmn/pmn
foram coletados e utilizados para a análise dos haplótipos.
O segundo cruzamento foi um intercruzamento, •
realizado com os animais portadores dos marcadores fenotípicos
Extra-toe (Xt) e pearl (pe). Esses cruzamentos foram realizados
para (1) conﬁrmar a localização cromossômica da mutação
pmn estabelecida com a análise do resultado do cruzamento
interespecíﬁco descrito acima e (2) para integrar o lócus pmn
num mapa consenso do cromossomo 13 de camundongos,
considerando que a mutação Xt também pode ser identiﬁcada
molecularmente através da sonda Gli20.
Extração do DNA
O baço e, em alguns casos, o cérebro e os rins dos
animais homozigotos para a mutação pmn foram coletados e
75
Material e Métodos Utilizados no Estudo da Mutação pmn
congelados imediatamente no nitrogênio líquido. Esses órgãos
foram, em seguida, triturados no nitrogênio líquido, e o pó
obtido foi dissolvido em 5ml de tampão de lise (50mM Tris pH
8; 100mM EDTA pH 8; 1% Sarcosyl). Após 1 hora de incubação
a 55°C, foram acrescentados a esse tubo 15µl de proteinase K
(20 mg/ml) para cada ml de tampão de lise. A mistura obtida
foi incubada a noite toda a 55°C. Após esse tempo, foram
adicionados ao tubo 20µl de RNAse (10mg/ml). Depois de
uma incubação a 37°C durante 30 minutos, 4 extrações
sucessivas foram realizadas (2 de fenol, 1 de fenol/ clorofórmio
e 1 de clorofórmio). A solução de DNA obtida foi, em seguida,
submetida a uma diálise (tampão de diálise: 10mM Tris pH 4,7;
0,1mM EDTA) duas vezes durante 24 horas numa temperatura
de 4ºC. A qualidade do DNA extraído foi veriﬁcada através de
um gel de agarose 0,3%. O peso molecular médio obtido foi
julgado satisfatório quando superior a 40Kb. A concentração
do DNA foi calculada pela medida da densidade ótica a 260
nm e o grau de pureza foi apreciado pela comparação com a
densidade ótica a 280 nm.
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Iniciadores
Os dados relativos aos marcadores microssatélites testados
(seqüências, motivos de repetição, condições de ampliﬁcação,
tamanho do fragmento ampliﬁcado) foram descritos em diversas
publicações: AITMAN et al., 1991; CORNALL et al., 1991;
DIETRICH et al., 1992; HEARNE et al., 1991; LOVE et al., 1990;
MONTAGUTELLI et al., 1991.
Condições de amplificação
De forma geral, as reações de ampliﬁcação foram
efetuadas em 25ml com as concentrações ﬁnais seguintes: 10mM
Tris pH 8,4; 50mM KCL; 0,1% Tween 20; 200mM de dATP,
dCTP, dGTP, dTTP (Pharmacia). A concentração ideal de Mg2+
foi determinada para cada par de iniciadores. 100ng de DNA
e 0,6 U de Taq Polimerase (Amersham) foram utilizados para
76
Material e Métodos Utilizados no Estudo da Mutação pmn
cada reação. As reações foram efetuadas nos termocicladores
LEP PREM III e TECHNE PHC-3, seja em tubos (40 tubos), seja
em placa de Elisa (96 poços). Três programas diferentes foram
utilizados de acordo com os iniciadores:
40 ciclos (1’ a 94°C, 1’ a 55°C, 30” a 72°C) precedidos •
por uma desnaturação de 3’ a 94°C e seguidos de uma extensão
ﬁnal de 3’ a 72°C;
10 ciclos (1’30” a 92°C, 1’ a 55°C, 30” a 72°C), 40 •
ciclos (1’30” a 94°C, 1’ a 55°C, 30” a 72°C), o todo precedido
de uma desnaturação, seguida de uma extensão ﬁnal;
35 ciclos (45” a 94°C, 1’30” a 55°C) precedidos por •
uma desnaturação de 3’ a 94°C e seguidos de uma extensão
ﬁnal de 3’ a 72°C.
Análise dos produtos de PCR
Os produtos das diferentes reações de ampliﬁcação foram
separados num gel de agarose 4% (1% agarose, 3% Nusieve) no
tampão TBE (90mM Tris, 90mM ácido bórico, 2mM EDTA) e
visualizados na presença de brometo de etídio ou em de gel de
acrilamida a 8% a ﬁm de melhorar a resolução das bandas.
Análise do polimorfismo dos microssatélites pela SSCP
Para tanto, as reações de PCR foram feitas num volume
de 10µl, a composição e concentrações dos reagentes foram as
mesmas, a não ser pelo dCTP frio, que foi substituído pelo dCTP
radioativo α33P (0,05mM concentração ﬁnal). Os produtos de
PCR foram diluídos em EDTA 20mM e SDS 0,1%. Uma amostra
de 2µl de cada diluição foi misturada a 2ml do tampão de
parada do seqüenciamento (blue stop). Essas amostras foram, em
seguida, desnaturados a 90°C durante 5 minutos e colocadas,
imediatamente, no gelo. Logo depois, as amostras foram
separadas num gel de acrilamida não desnaturante (acrilamida
6%) e visualizados por auto-radiograﬁa.
77
Material e Métodos Utilizados no Estudo da Mutação pmn
Análise dos resultados
Para cada marcador microssatélite foi examinado a
distribuição dos heterozigotos (dois produtos de ampliﬁcação
de tamanhos diferentes) e a dos homozigotos (um único produto
de ampliﬁcação). Os resultados foram analisados por meio de
um programa chamado GENE-LINK (MONTAGUTELLI, 1990),
que calcula, para cada caso, as probabilidades de ligação entre
os loci.
A coleção de DNA do EUCIB
Para estabelecer um mapa genético de alta resolução em
torno do lócus pmn, utilizou-se a coleção de DNA do European
Collaborative Interspecific Backcross. Essa coleção de DNA
formada por 982 amostras, ou seja, 982 meioses originou-se de
dois cruzamentos em retorno interespecíﬁcos complementares:
um do tipo (C57BL/6 x Mus spretus) F1 x C57BL/6 e outro do tipo
(C57BL/6 x Mus spretus) F1 x Mus spretus. Todas essas amostras
foram utilizadas no mapeamento dos marcadores microssatélites
disponíveis localizados no cromossomo 13. Dessa forma, o
mapeamento da sonda Gli20, que corresponde ao lócus Gli3 o
qual cosegrega constantemente com pmn (maiores detalhes no
estudo de caso), possibilitou integrar o lócus pmn num mapa
molecular consenso e de alta resolução.
Protocolos experimentais utilizados no estabelecimento do
mapa físico
Preparação
do DNA de levedura em blocos de agarose (adapta-
do de BIRREN at al., 1993)
O DNA de levedura foi preparado a partir dos esferoplastos
com o uso de Novozyme, os quais foram lisados com o dodecil
sulfato de lítio. Essa técnica, que nos permite obter cromossomos
de levedura intactos, com cada bloco chegando a conter entre
1 e 2µg de DNA, tem um princípio bem simples: uma colônia é
inoculada num meio seletivo, sem triptofano nem uracila (meio
78
Material e Métodos Utilizados no Estudo da Mutação pmn
AHC, Current Protocols in Human Genetics, 5.5.7.), e cultivada a
30ºC. Uma parte dessa pré-cultura foi transferida para um meio
rico (YPD, Current Protocols in Human Genetics, 5.5.8.) para a
obtenção de uma cultura próxima à saturação, no dia seguinte
(D.O. à 600nm = +/- 3). A cultura, em seguida, foi centrifugada e
o pellet ressuspenso em uma solução contendo 10mM Tris-HCl
pH 7,5, 50mM EDTA pH 7,5 e lavado uma segunda vez em 10ml
de SCE (1 M sorbitol; 0,1 M citrato de sódio pH 5,8; 10 mM EDTA
pH 7,5). Após centrifugação, as células foram ressuspendidas
num volume de SCE tal que a concentração em células fosse
a de 4 x 109 células por ml. Acrescentou-se, então, um volume
igual de agarose Seaplaque GTG (FMC) 1,5 % preparada no SCE
e contendo 8 mg/ml de Novozyme (Sigma, L3768), e o todo
foi conservado a 50°C. A mistura foi rapidamente colocada
em formas de Plexiglas para formar blocos. Para a formação de
esferoplastos, os blocos foram transferidos para uma solução
de SCE contendo 10 mM de DTT e incubados 2 horas a 37°C.
A lise das células foi realizada numa solução contendo 1% de
dodecil sulfato de lítio, 100 mM EDTA e 100 mM Tris-HCl pH 8
durante 16 horas. Os blocos foram, em seguida, lavados no TE
(10mM Tris-HCL pH 8; 1 mM EDTA pH 8) e conservados em 10
mM Tris e 10 mM EDTA a 4°C.
Alguns lotes de Novozyme não são, porém, totalmente
puros e podem conter DNAse. Cada lote desse produto deve,
então, ser testado individualmente.
Eletroferese e campo pulsado e hibridização
Com a utilização do aparelho CHEF DR II (Biorad), o qual
produz um campo elétrico homogêneo a partir de um dispositivo
hexagonal de 24 eletrodos, estes são ativados de tal forma que
produzem alternativamente dois campos elétricos, nos quais os
vetores de corrente formam um ângulo de 120º um em relação
ao outro. A concentração da agarose, a concentração e a
temperatura do tampão, a voltagem, a duração das pulsações e
a duração total da eletroferese são fatores que afetam o resultado
ﬁnal da migração (BIRREN et al., 1993).
79
Material e Métodos Utilizados no Estudo da Mutação pmn
Na prática, as eletroforeses são realizadas na agarose
Seakem GTG (FMC) a uma concentração de 1% em 0,5 x TBE.
As condições da eletroforese são adaptadas ao tamanho do DNA
que será separado, seguindo-se as recomendações de Birren e
Lai (1993). A quantidade de DNA depositada em cada pista não
deve ultrapassar 10 mg. Foram utilizados como marcadores de
peso molecular os cromossomos de Saccharomyces cerevisiae
(16 cromossomos de 225 a 1900 Kb; Yeast chromosome PFG
Marker, New England Biolabs) e um padrão de concatâmeros de
fagos Lambda (padrão de 48,5 Kb a 1018 Kb, Lambda Ladder
PFG Marker, new England Biolabs).
Para a análise em Southern, o DNA, após a migração,
foi transferido para uma membrana de Nylon N+ da seguinte
maneira: após coloração no brometo de etídio, o DNA foi
depurinado em HCl 0,25 N durante 8 minutos; em seguida,
foi neutralizado por 30 minutos em 0,5 M Tris-HCl pH 7. A
transferência para a membrana foi realizada em 1,5 M NaCl; 0,5
M NaOH, durante toda a noite. Após esse tempo, a membrana
foi neutralizada em Tris-HCl 0,5 M pH 7 e, em seguida, foi
lavada em 2 x SSC (0,33 M NaCl; 0,03 M Na3-citrato-2H2O).
As hibridizações foram realizadas na presença do
tampão de hibridização Church, a 65°C, a noite toda. Após
a hibridização, os ﬁltros foram lavados no SSC 0,1%, SDS, a
65°C.
Isolamento das extremidades dos cromossomos artificiais de
levedura pela PCR-inversa (adaptado de ARVEILER; PORTEUS, 1991)
O DNA do YAC foi digerido por uma enzima cujo sítio de
restrição está presente no vetor. O DNA digerido foi, em seguida,
religado sobre si mesmo. Entre as moléculas circulares, algumas
possuem um fragmento do vetor flanqueando uma extremidade
do YAC. Utiliza-se, em seguida, iniciadores especíﬁcos do vetor
para ampliﬁcar a extremidade do YAC (Figura 37).
Na prática, meio bloco de DNA de levedura (0,5 a 1 ng
de DNA) foi digerido durante 3 horas por enzimas apropriadas
80
Material e Métodos Utilizados no Estudo da Mutação pmn
(braço esquerdo: TaqI, RsaI, EcoRV; braço direito: PstI, RsaI,
EcoRV). Recomenda-se acrescentar soro de albumina bovina
(BSA) e espermidina. Após digestão, os blocos foram lavados
em 10 mM Tris-HCl pH 7,5 e em 10 mM EDTA e colocados
dentro de 200 a 400 µl (1/2 ou 1 bloco) do tampão de ligação
1X. Após incubação durante 10 minutos a 65°C, o ATP foi
acrescentado a uma concentração ﬁnal de 1 mM, 2 unidades
de B-agarose (Calbiochem) e 40 unidades de ligase (Biolabs).
A mistura foi incubada durante 2 horas a 37°C, seguida de
uma hora à temperatura ambiente e, ﬁnalmente, a noite toda a
14°C. Dessa mistura, 5 µl foram utilizados para a PCR. A reação
de ampliﬁcação foi realizada em 100µl com 100 ng de cada
iniciador:
Braço esquerdo: 1. GAATTGATCCACAGGACGGG
2.GCCAGTTGGTTTAAGGCGC
Braço direito: 1. GGAAGAACGAAGGAAGGAGC
2. GCCCGATCTCAAGATTACG
Condição de ampliﬁcação: 95°C, 5 minutos, seguido de
30 x 94°C 45 segundos; 60ºC, 1 minuto; 72°C, 2 minutos. Os
produtos foram analisados em gel de agarose e clonados.
Mapa de restrição do contig de YAC
O mapa de restrição do contig foi construído através da
execução de digestões totais e parciais do DNA dos YAC. Na
prática, os blocos são lavados quatro vezes durante 30 minutos
no TE a 40°C e equilibrados no tampão de restrição 1X durante
60 minutos no gelo (utilizar 300 µl ﬁnais para cada bloco de
100ml).
O tampão de restrição 1X é, em seguida, substituído por
uma solução de digestão completa, ou seja, tampão de restrição
1X, soro de albumina bovina 500 mg/ml, espermidina nas
respectivas concentrações (5 mM para os tampões de restrição
cuja concentração em sal seja de 50-100 mM; 10 mM para
81
Material e Métodos Utilizados no Estudo da Mutação pmn
aqueles cuja concentração em sal seja superior a 100 mM), 1
mM de DTT e um número adequado de unidades de enzima.
Não se deve colocar a espermidina nas digestões com a enzima
SfiI. A reação é colocada um hora no gelo antes da incubação
à temperatura adequada. As digestões completas são realizadas
a noite toda.
Para reações parciais, utiliza-se o mesmo número de
unidades de enzima colocado na digestão completa, porém
o tempo de incubação é modiﬁcado. Em geral, tempos de
incubação entre 8 a 20 minutos são suﬁcientes para se obterem
bons resultados na digestão parcial (HAMVAS et al., 1994). As
condições de digestão parcial devem ser testadas para cada
preparação de DNA em bloco de agarose. As reações são
paradas acrescentando-se ao tubo 500µl de EDTA 500mM no
gelo. Recomenda-se lavar os blocos no tampão de eletroforese
antes de carregar o gel.
Após a eletroforese e transferência na membrana de
Hybond-N+, os produtos de digestão parcial são revelados através
da sonda de um fragmento do DNA que reconheça ou o braço
direito do pYAC4 (fragmento PvuII/ SalI de 1.4 Kb proveniente da
digestão do plasmídio pBR322) ou o braço esquerdo do pYAC4
(fragmento PvuII/ EcoRV de 2,3 Kb proveniente da digestão do
plasmídio pBR322). Os fragmentos provenientes da digestão
total são revelados com o DNA genômico de camundongos ou
o DNA Cot-1 (Life Technologies).
Preparação do DNA genômico a partir do BAC
A preparação do DNA genômico a partir do BAC é
idêntica a uma
miniprep de DNA a partir das bactérias. As
células cultivadas durante toda a noite a 37°C no meio LB +
cloramfenicol são centrifugadas por 30 minutos (1,5 ml de
células). O meio é descartado e o pellet é ressuspendido em 100
µl da solução I (50 mM glucose; 20 mM Tris-HCl pH 8; 10 mM
EDTA pH 8). Os tubos são, então, colocados no gelo e a eles
são acrescentados 200 µl da solução II (0,2 N NaOH; 1% SDS),
agitando-os de 7 a 9 vezes, quando são recolocados no gelo.
82
Material e Métodos Utilizados no Estudo da Mutação pmn
Acrescentam-se, em seguida, 150 µl da solução III (acetado de
potássio 3 M pH 4,8) e os tubos são agitados novamente. Segue-
se uma centrifugação à temperatura ambiente durante 1 minuto
e o sobrenadante é transferido para um novo tubo. Segue-se
uma precipitação com etanol. Os pellets são ressuspendidos em
20 µl de TE e são pegos 5 µl para a digestão enzimática.
A migração em campo pulsado foi feita durante 18
horas. A duração das pulsações foi estabelecida em 5 segundos
durantes 6 horas no começo; em seguida, ela passou a 10
segundos durantes 6 horas e, ﬁnalmente, 15 segundos durantes
6 horas. Para essa migração utilizou-se um gel de agarose 1% e
0,5 x TBE a 14°C.
Isolamento e caracterização das seqüências codificadoras
RT-PCR
O RNA total foi extraído utilizando-se o método de uma
única etapa descrito por Chomcznski e Sacchi (1987) e adaptado
pela Biolabs.
As reações de RT-PCR foram realizadas essencialmente
como descritas por Kawasaki e outros (1990). Dois mg de
RNA total foram tratados com uma unidade de DNAseI (Life
Technologies) durante 30 minutos à temperatura ambiente. A
reação foi parada acrescentando-se ao tubo 2 mM de EDTA e
incubado durante 10 minutos a 65°C. Essa técnica também pode
ser iniciada utilizando-se 200 ng de RNA poly(A+), o que evita
o tratamento posterior com a RNAse. A primeira ﬁta de cDNA
é sintetizada através da transcriptase reversa Superscript II (Life
Technologies): 200 unidades de Superscript são colocadas ao
RNA na presença de 10 picomoles de hexâmeros aleatórios e 10
picomoles de cada dNTPs. A reação de transcrição é realizada a
37°C (ou 42°C) durante 30 minutos num volume ﬁnal de 20 µl.
Dois µl da reação são utilizados para a ampliﬁcação pela PCR
com iniciadores especíﬁcos do lócus estudado. Toda reação de
transcrição reversa do RNA deve ter uma reação de PCR controle
que não contenha a RT-PCR. Os produtos de ampliﬁcação são
83
Material e Métodos Utilizados no Estudo da Mutação pmn
revelados pela hibridização através de uma sonda especíﬁca,
após migração em gel de agarose e transferência em membrana
de nylon Hynbond-N+.
Amplificação dos éxons
O princípio da captura dos éxons foi apresentado na
introdução e pode ser visualizado na Figura 38.
O vetor pSPL3
O vetor de expressão pSPL3 (Figura 39) contém uma origem
de replicação para a bactéria E. coli, um gene de resistência
a ampicilina e um segmento do vírus SV40 para replicação e
transcrição das células eucariotas COS-7. Um sítio de clonagem
múltipla foi inserido no íntron do gene Tat do HIV. Esse íntron
está cercado pelos sítios doador e aceptor de emenda. Esse
conjunto, por sua vez, está cercado das seqüências exônicas do
gene Tat e do gene da β-globina.
Um dos inconvenientes desse vetor é a presença de
um sítio crítico de splicing. Caso ocorra um processamento
dos íntrons através deste sítio, o resultado será um éxon dito
quimérico.
Os produtos dos processamentos das seqüências do
vetor sozinho, das seqüências desprovidas de éxon genômico
e também daquelas provenientes do processamento quimérico,
podem ser eliminados através de uma digestão enzimática.
Para a clonagem no vetor pSPL3, o DNA do BAC é
digerido pela enzima de restrição BamHI e BglIII (ou somente
BamHI) e ligado ao vetor que foi igualmente digerido por BamHI
e desfosforilado. Um controle é realizado ligando-se o vetor a
ele mesmo, sem inserto. Após eletroporação, 100 µl da reação
são semeados no meio de cultura LBA, o restante da solução de
clonagem é utilizado na cultura líquida. Avaliamos a qualidade
da clonagem comparando a eﬁciência, ou seja, o número de
colônias obtidas entre a clonagem-teste e o controle. Uma
84
Material e Métodos Utilizados no Estudo da Mutação pmn
clonagem é considerada eﬁciente quando o número de colônias
obtidas na clonagem-teste é 10 vezes superior ao do controle.
Transfecção das células COS-7
As células COS-7 são originadas dos rins de um macaco
verde, as quais foram transformadas, por derivado do SV40
defeituosos, no sítio correspondente à origem de replicação.
Essas células assim modiﬁcadas permitem a replicação ativa do
vetor que, como o pSPL3, contém as seqüências ARS do SV40
ausentes nas células hospedeiras.
Para tanto, 1µl do DNA plasmidiano é transferido para
as células COS-7 através do método de lipotransfecção, de
acordo com o protocolo da empresa (reativo Lipofectase, Life
Technologies). Observamos que qualquer contaminação das
células COS por micoplasmas é responsável pela perda total
do experimento. Dessa forma, é de suma importância que seja
veriﬁcado regularmente se essas células não estão contaminadas
pelos micoplasmas. Para tanto, o kit comercial Mycoplame PCR
Primer Set (Stratagene) permite o controle delas via PCR.
Isolamento do RNA citoplasmático
O RNA citoplasmático é isolado 48 a 72 horas após a
transfecção pelo método de extração utilizando o agente químico
tiocianato de guanidina e fenol-clorofórmio (CHOMCZYNSKI;
SACCHI, 1987).
Amplificação e clonagem dos éxons capturados
Os RNA produzidos pela transcrição do vetor pSPL3
podem ser ampliﬁcados pelos iniciadores especíﬁcos do vetor
(SA2, SD6, dUSD2 e dUSA4, Figura 39). As seqüências de cada
um deles são as seguintes:
SA2: ATCTCAGTGGTATTTGTGATC
(complementar às bases 3245 a 3275 do vetor pSPL3)
85
Material e Métodos Utilizados no Estudo da Mutação pmn
SD6: TCTGAGTCACCTGGACCACC
(complementar às bases 607 a 626 do vetor pSPL3)
dUSD2:
CUACUACUACUAGTGAACCTGCACTGTTGACAAGCT
(complementar às bases 651 a 671 do vetor pSPL3)
dUSA4:
CUACUACUACUACACCTGAGGAGTGAATTGGTCG
(complementar às bases 3178 a 3199 do vetor pSPL3)
A síntese da primeira ﬁta de cDNA é realizada utilizando-se
o iniciador SA2. Após tratamento da ﬁta de RNA com RNAaseH,
a ﬁta simples de DNA é convertida em dupla por um pequeno
número de ciclos de PCR através dos iniciadores SA2 e SD6.
Para serem eliminados os produtos oriundos do processamento
somente do vetor ou os produtos falsos positivos (processamento
quimérico), é necessário proceder a uma digestão completa
com a enzima BstXI. Nessa etapa, a qualidade da enzima é
fundamental para a eﬁciência do experimento. Uma parte do
produto de digestão é, em seguida, utilizado numa segunda
ampliﬁcação pela PCR com os iniciadores internos dUSD2 e
dUSA4, que contêm dUMP, para posterior clonagem no vetor
pAMP10 (Life Technologies), o qual permite a clonagem dos
produtos de PCR sem passar pela etapa de puriﬁcação. Se os
clones obtidos possuem insertos maiores que 177 pb, o que
corresponde à distância entre os iniciadores dUSD2 e dUSA4,
eles possuem a priori um éxon. Freqüentemente observamos a
produção de clones contendo fragmentos do vetor (seqüências
do HIV e globina), talvez em razão do sítio crítico presente no
vetor pSPL3. Por isso, antes de se proceder ao estudo dos éxons
ampliﬁcados, uma sondagem através de hibridização com sondas
de fragmentos de HIV e do vetor pSPL3 é realizada nos éxons
obtidos. Aqueles que reagirem positivamente à hibridização são
eliminados.
86
Material e Métodos Utilizados no Estudo da Mutação pmn
Sequenciamento
Métodos
As reações de seqüenciamento foram realizadas de
acordo com o método de Sanger, através do kit comercial
Sequenase II (USB), para um seqüenciamento
manual.
Análise das seqüências
As seqüências obtidas foram introduzidas num programa
chamado Genework. Cada seqüência foi comparada às já
existentes no banco de dados via BLAST, acessível por email no
National Center for Biological Information, NCBI (blast@ncbi.
nlm.nih.gov). Algumas das seqüências também foram analisadas
com o programa GRAIL, também acessível pela Internet, que
prediz a existência de seqüências codiﬁcadoras.
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WALLIN, J.; EIBEL, H.; NEUBUSER, A.; WILTING, J.; KOSEKI, H.;
BALLING, R.; (1996). Pax1 is expressed during development
of the thymus epithelium and is required for normal T-cell
maturation. Development, 122: 23-30.
WATERSON, R.H.; LINDBLAD-TOH, K. et al. Mouse Genome
Sequencing Consortium (2002). Initial sequencing and
comparative analysis of the mouse genome. Nature, 420
(6915): 520-62.
106
Referências Bibliográficas
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a mutant map of the mouse. Mammalian Genome, 11:
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making mutant mice. Genes, Brain and Behaviour, 2:
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YU, C.; OSHIMA, J.; FU, Y.H.; WIJSMAN, E. M.; HISAMA, F.;
ALISCH, R.; MATTHEWS, S; NAKURA, J.; MIKI, T.; OUAIS,
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ZHANG, J.; YANG-FENG, T.; MULLER, U.;
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LEOPOLD, L.; FRIEDMAN, J.; (1994). Positional cloning of
the mouse obese gene and its human homologue. Nature,
372: 425-432.
107
Anexos
ANEXO I- FIGURAS
Clonagem pela Função Clonagem Posicional
Doença Doença
Mapeamento MapeamentoFunção Função
Gene Gene
Figura 1: As estratégias da clonagem
Ilustração das duas estratégias de que dispomos para conhecer a função
de um gene qualquer.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
108
Anexos
Figura 2: Mutação alcaptonúria (aku).
A urina do animal doente torna-se escura após o contato com o ar após
o processo de oxidação. Na foto, o animal afetado está à direita; e à es-
querda, o normal.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
109
Anexos
Figura 3: Animal modelo da fenilcetonúria (PKU) humana.
Os camundongos pertencem à mesma linhagem (BTRB). A despigmenta-
ção observada no animal de cor marrom (à direita) é um componente da
síndrome da feniltonúria.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
110
Anexos
900 800 700 600 500 400 300 200 100 0
Humans
Mice
Xenopus
D.
Melagonaster
C. elegans
myr bp
Figura 4: Relações evolutivas entre os modelos mais utilizados em labo-
ratório.
Os tempos aproximados em divergências evolutivas entre organismos
citados e seus ancestrais comuns estão indicados ao longo de uma linha do
tempo, numa escala de milhões de anos (SIILVER, 1995).
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
111
Anexos
X
Y
XY
X; Y
UN
MT
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 X Y XY UN MT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
Total Orthologies: 10137
Total mapped in booth species: 9677
mouse, laboratory
mouse, laboratory
h
u
m
a
n
h
u
m
a
n
1 1
1
1
1
1
1 1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
11 1
1
1
11
1
1
1
11
11
11
11
11
1
1
1
1 1
1 1
1
1
1
1
1
1
1
1
274 3 282 355 10 4 18 12 2 15 58
249 124 32 81 2 41
41
41
50 2 62 5
5
39
79 76 191 54 135
37
20
12
7
3
11
28
6
25
11
13
12
8
21
32
16
12
16
20
20
14
11
23
2
2
2
2 2
2
2
2 23
3
3
3
3
3
3
3
34
4
7
5
5
8
10
10
10
10
257
9
79 80
13 11 21 29 111 45
92 2034
275 98 37 76 45
370
16 104
96 205
128
207
579
82
99
106
48 60
15 19 36
36
43
132
148
157
158
44
105 140
20572
45
127
34 3419
140
12 50
59 112
195 171
79
33 15
248
44 134
112
159107
11833
61211104
18 22
Figura 5: Oxford Grid.
Cada célula representa uma comparação entre dois cromossomos – um do
camundongo e outros do homem. O número de ortologias aparece entre
cada célula (Cinza 1; Azul 2-10; Verde 11-25; Alaranjado 26-50; Amarelo 50
ou mais). FONTE: MGI ( www.informatics.jax).
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
112
Anexos
Figura 6: A mutação pmn
A fraqueza dos animais pmn (à direita na foto) caracteriza-se pela incapaci-
dade de esticar os membros posteriores quando são erguidos pela cauda.
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113
Anexos
a b
cd
A
A
Figura 7: Cortes histológicos.
(a) Corte do músculo sóleo de um animal homozigoto com quatro sema-
nas, já apresentando uma atrofia neural. A largura das fibras é normal. (b)
(c) são terminações nervosas do mesmo músculo. O axônio terminal (A)
apresenta-se inchado e não possui vesículas sinápticas (b), ou estas estão
diminuídas (c). (d) Corte longitudinal de um nervo plantar de um camun-
dongo mutante de cinco semanas. As mielinas restantes têm formato
redondo ou oval, indicando um processo de degeneração axonal. Barras:
50mm (a, d) e 1mm (b, c) .
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114
Anexos
ba
Figura 8: Nervo frênico.
Corte do nervo frênico de um animal normal (a) e de um animal mutante,
ambos com quatro semanas. Pode-se notar uma abundante perda dos
axônios mielinisados.
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115
Anexos
Figura 9: Fenótipo obeso.
O animal na parte superior da foto é obeso, conferido por uma mutação
espontânea no gene da leptina. A leptina (Lep) é uma proteína envolvida
na regulação dos lipídeos. Ela está presente predominantemente nos
tecidos adiposos. Nos camundongos homozigotos para mutação obese,
o gene Lep está mutado e a leptina está ausente. Esses animais ingerem
uma quantidade excessiva de alimentos (hiperfagia) e possuem diabete,
intolerância à glicose e uma concentração de insulina plasmática elevada.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
116
Anexos
10 Mb (5-10 c M) A
A
B
B
C
D
100 Kb
10 Kb
...TAGCTGCTAGCTA...
...TAGCTGGTAGCTA...
éx
on
ín
tr
on
Figura 10: Principio da clonagem posicional.
O esquema acima representa uma clonagem, utilizando-se os clones do
tipo YAC (Yeast Artificial Chromosome). O mesmo pode ser feito com os
BAC (Bacterian Artificial Chromosome). Nesse esquema, a mutação que le-
vou ao aparecimento do fenótipo anormal é uma transição de uma citosina
para uma timina, o que causou a troca de um aminoácido leucina por um
códon de parada, característico de uma mutação de sentido trocado.
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117
Anexos
Camundongo A
Linhagem BLACK
X
X X
Camundongo B
Linhagem WHITE
F1 Híbrido
Retrocruzamento Intercruzamento
N2 F2
Figura 11: Tipos de cruzamentos utilizados nos projetos de mapeamento.
O intercruzamento, utilizado em mapeamentos de mutações recessivas,
produz dois cromossomos informativos (resultantes dos eventos de
recombinação para cada indivíduo Fl do casal estabelecido). O retrocru-
zamento pode ser utilizado, tanto para o mapeamento de mutações ou
traços recessivos como de dominantes; o que varia é o parental utilizado
no cruzamento com Fl. Nesse tipo de esquema, é produzido apenas um
cromossomo informativo (resultante dos eventos de recombinação do
indivíduo Fl utilizado).
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118
Anexos
retrocruzamento
X
locus 1
n
N
m
+
locus 2
r
n m r
n
n
m r
n m
m
n m r
n m rR
análise de 1000 descendentes
gamentas do heterozigoto
haplótipos não
informativos
haplótipos informativos
N + R
N
N
N
+
+
+
R
R
R
R
R
locus 1 mutação locus 2
descendentes
fenotipagem
[+]
[+]
[m]
[m]
[+]
[+]
[m]
[m]
genótipos para os
dois marcadores
N/n
R/r
n/n
r/r
N/n
N/n
N/n
R/r
R/r
R/r
n/n
n/n
n/n
r/r
r/r
r/r
animais não
informativos
animais
informativos
(genotipados
com outros
marcadores)
Figura 12: Estratégias do mapeamento.
Identificação dos animais informativos para refinar a localização da muta-
ção (no caso de um retrocruzamento).
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119
Anexos
5 4 3 2 1
domesticus
musculus
molossinus
castaneus
bacterianus
M
u
s m
u
scu
lo
s
spretus
spicilegus
macedonicus
fragilicauda
famulus
caroll
cooki
cervicolor
dunni
Pyromys
Coelomys
Nannomys
Su
b
g
en
u
s M
u
s
O
th
er
su
b
g
en
era
TRENDS in Genetcs
Figura 13: Árvore filogenética da ordem muridae.
Por meio da análise de dados moleculares coletados a
partir da comparação
das seqüências de DNA mitocondrial e genômico, nós podemos reconhecer
várias espécies diferentes de camundongos pertencentes ao gênero Mus.
FONTE: Guénet et Bonhomme, Trends in genetics, vol. 19, pp. 20-31, 2003.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
120
Anexos
Alelo 1 Alelo 2
R1 R1R2 R3 R3
sonda sonda
linhagem 1 linhagem 2
locus A locus A
Figura 14: Ilustração do principio de RFLP (Polimorfismo de Comprimento
de Fragmentos de Restrição.
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121
Anexos
Alelos
#1
#2
#3
CACACACACACACA
CACACACACACACACACACACA
CACACACACACACACACA
Genótipos
1/1 2/2 3/3 1/2 1/3 2/3
Figura 15: Meios microssatélites e sua detecção.
Três alelos diferentes de um locus microssatélite composto de repetições
CA. As setas representam os iniciadores locus específico utilizados na am-
plificação. No esquema que se segue está representado um gel de eletro-
forese com os padrões que seriam observados para os diferentes alelos.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
122
Anexos
DNA fita dupla
CGTAGCTGATCGATGC
GCATCGACTAGCTACG
CGTAGCTGGTCGATGC
GCATCGACCAGCTACG
Fita 1
Fita 2
Amostra A
Fita 1
Fita 2
Amostra B
Corrida no gel
Amostra A Amostra B
Sentido da
migração do
DNA
Desnaturação
e
Resfriamento
Figura 16: SSCP - Alelos e sua detecção.
A conformação tridimensional assumida pela fita simples de DNA após
resfriamento interfere diretamente na velocidade de migração no gel. A
conformação é dependente da seqüência que a fita apresenta. Sendo as-
sim, seqüências diferentes (mesmo em apenas uma base) terão diferentes
velocidades de migração. Neste esquema estão ilustradas duas amostras
com uma base de diferença em suas seqüências; após desnaturação e
resfriamento a conformação que cada fita assume; em seguida um gel
revelando o polimorfismo existente
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
123
Anexos
Figura 17: Mapa comparativo das regiões de ortologia entre o cromos-
somo 13 murino (à direita) e os segmentos cromossômicos 1, 3, 5, 6, 7, 9
e 10 humanos.
Os histogramas representados do lado direito do cromossomo 13 murino
correspondem aos cromossomos humanos homólogos. O número de cada
cromossomo está indicado acima do histograma. O tamanho de cada uma
das barras posicionadas nos histogramas indica o número de genes ortólo-
gos entre o homem e o camundongo localizados naquela região. Fonte:
www.informatics.jax.org.
Cr. 13
7
9
6
1
10
3
5
10
c
M
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
124
Anexos
Vetor pYAC
TELTEL
Sítio de clonagem
O vetor é digerido de
tal forma que libere os
dois braços
Braço esquerdo
Tranformação de esferoplastos e
propagação na Saccharomyces cerevisiae
Ligação
Braço direito
TELTEL
Digestão parcial
(produção de fragmentos
de várias centenas de Kb
DNA genômico
TRP
ARS
CEN
URA
Figura 18: Princípio da clonagem em YAC.
O vetor de clonagem (pYAC) é digerido de maneira a produzir dois braços.
O braço esquerdo contém a região denominada ARS (origem de replicação
autônoma), um centrômero (CEN), uma seqüência que permite a formação
de um telômero funcional in vivo (TEL) e um marcador de seleção (TRP). O
braço direito contém a seqüência TEL e um segundo marcador de seleção
(URA). A ligação desses braços a grandes fragmentos de DNA genômico
(humano, animal, etc) obtidos pela digestão parcial conduz à formação do
cromossomo artificial de levedura (YAC), o qual é introduzido dentro do
organismo Saccharomyces cerevisiae. Nele, o YAC é capaz de se replicar
(graças à seqüência ARS), de estabilizar sua extremidades (graças às se-
qüências TEL) e de se repartir de maneira correta entre as células filhas no
momento da divisão celular (graças às seqüências CEN).
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
125
Anexos
Hind III Bam HI Xmal, Smal,
Notl, Bgll, Sfil
Nat I Eag I
Sacl
SaclSal I Sal I
pBAC108L
CM
R
pa
rB
pa
rA
repE
or
iS
loxP
cosN
promotor T7 promotor Sp6
Figura 19: Construção do vetor BAC.
O vetor BAC é um derivado do epsomo F e possui os genes oriS e repE
— que regulam a replicação — e os genes parA e parB que controlam o
número de cópias do plasmídio ( uma ou duas) na bactéria. CMR é o gene
de resistência ao antibiótico cloramfenicol. No sitio de clonagem, o vetor
BAC possui: (i) os sítios cosN e loxP do bacteriófago lambda e (ii) dois
sítios de clonagem (HindIII e BamHI). As seqüências dos promotores T7 e
SP6 servem para o seqüenciamento da porção de DNA inserida na junção
vetor- inserto.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
126
Anexos
DNA genômico de alto
peso molecular
Digestão e fragmentação de
grandes fragmentos de DNA
(várias centenas de Kb)
Ligação na presença de um
marcador de seleção e em
baixa concentração de DNA
Circularização dos fragmentos de DNA
Digestão
Fragmento de junção
Clonagem dos fragmentos de DNA no vetor
adequado, por exemplo, um bacteriófago
Banco de fragmentos de “jumping”
Sondagem de uma biblioteca através do
Figura 20: Ilustração da técnica do salto no cromossomo.
O DNA genômico é digerido e os produtos são ligados na presença de um
marcador de seleção – por exemplo, o gene supF – cuja presença deste
marcador permite selecionar os clones de junção (aqueles que contêm
os fragmentos de DNA que normalmente estariam distantes um do outro
no genoma de origem). As moléculas de DNA circular são, em seguida,
digeridas por uma endonuclease compatível com a clonagem em um vetor
adequado. A maior parte das moléculas obtidas correspondem ao DNA
contíguo e apenas uma pequena porção de fragmentos pertencem ao DNA
de junção. Uma biblioteca é então construída, utilizando, por exemplo, um
bacteriófago. O fago só poderá se propagar se tiver o marcador de seleção
supF. Isso quer dizer que apenas os clones que contêm o fragmento de
junção estarão presentes na biblioteca. Um fragmento de DNA pode ser
isolado pela sondagem da biblioteca por meio de uma sonda de DNA,
mesmo localizado a várias dezenas ou centenas de Kb daquela sonda.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
127
Anexos
contig n
BAC n°1
BAC n°2
BAC n°3
marcha sobre
o cromossomo
contig n contig n+1
contig n+1
DNA cromossômico
intervalo entre dois
contigs está definido
seqüenciamento da extremidade do BACn°1
definição de uma STS
Busca de novo BAC portando tal STS (sondagem de biblioteca)
seqüenciamento da extremidade do BACn°2
definição de uma STS
sondagem de biblioteca
Figura 21: A marcha sobre o cromossomo.
O sequenciamento da extremidade do BAC n° 1 fornece uma sequência
única amplificada pela PCR (STS). Um BAC portador desta sequência é
procurado numa biblioteca genômica. Este BAC permite aumentar a região
clonada. Pode-se igualmente utilizar a outra extremidade do BAC n° 1 para
“marchar” sobre o cromossomo “para o outro lado”.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
128
Anexos
mRNA
cDNA
PCR
PCR
Retrotranscrição
Extração do RNA citoplasmático
Transfecção dos mRNA
Emenda
Tranfecção em célular de mamíferos
éxon éxoníntron
SA
SA
SD
SD
Vetor de expressão
sítio de poliadenilação
Fragmento genômico contendo um éxon
AAAAAAAAAAA
= éxon cerdado pelas
seqüências do vetor
Figura 22: Princípio da amplificação dos éxons internos ou Éxon-
Trapping.
Os genes, nos organismos eucariotos, apresentam-se em forma de mo-
saicos, em que as seqüências codificantes (éxons) são interrompidos por
seqüências não codificantes (íntrons). Os íntrons são transcritos antes
de serem eliminados num processo denominado de emenda (splicing).
Quatro seqüências de
DNA têm papel importante nesse processo: o sítio
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
129
Anexos
doador de emenda (SD) em 5’ do íntron, o sítio aceptor de emenda (SA)
em 3’ do íntron, o sítio de junção e uma região de resíduos pirimidinas.
Na amplificação do éxon, o DNA genômico a ser analisado é clonado num
vetor de expressão. O sítio de clonagem está localizado dentro de um
íntron de um dado gene e é, portanto, enquadrado pelos sítios doador e
aceptor de emenda. Em seguida, a construção é colocada para propagação
dentro da bactéria E. coli. O DNA é então isolado e transfectado nas células
eucariotas. Caso o DNA analisado contenha um éxon e que este tenha sido
inserido na orientação correta, ou seja, de 5’ para 3’, ocorrerá à emenda
entre as seqüências do vetor e do inserto. O produto final dessa emenda
será um RNAm quimérico que possui a seqüência do éxon do DNA testado,
enquadrado pela seqüências dos éxons do vetor. Tais moléculas de RNA
são extraídas e convertidas em cDNA pelo método de RT-PCR (retrotran-
scrição). As moléculas de cDNA são, então, amplificadas pela PCR através
dos oligonucleotídios específicos do vetor. Caso o produto de amplificação
seja maior em pb que a distância que separa os oligonucleotídios no vetor,
é um forte indicativo de que um éxon foi clonado.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
130
Anexos
Digestão do DNA genômico (YAC, ...)
+ adaptador
+ iniciador biotinilado
PRC
Hibridização em meio líquido
Captura do híbrido sobre as
bilhas de estreptavidina
bilha magnética
+ estreptavidina
Educação do
cDNA
Amplificação
Clonagem
Biblioteca de DNA
Figura 23: Captura de cDNA por afinidade
O DNA genômico é digerido e ligado aos adaptadores. A construção é en-
tão amplificada através de oligonucleotídios biotinilados e específicos dos
adaptadores. O DNA amplificado é, em seguida, hibridizado, em condição
de alta estringência, a moléculas de cDNA. Os híbridos cDNA-DNA genômico
biotinilado são recuperados por meio de bilhas magnéticas cobertas de es-
treptavidina. Os cDNA não específicos são eliminados por meio de lavagem.
Os cDNA específicos restantes são eludados, amplificados e clonados.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
131
Anexos
3’ RACE
5’ RACEmRNA
Adaptador
cDNA
GSP1
GSP2
AAAAAAAAAAAAAAAAA3’
AAAAAAA3’
TTTTTTT
TTTTTTT
TTTTTTT
TTTTTTT
Iniciador
complementar
ao adaptador
Iniciador
complementar
ao adaptador
5’
mRNA
5’
GSP
GSP
GSP
GSP
cDNA
Acréscimo de uma
cauda poli (dC)
(dC)n
CCCCCCCCCC
(dC)n
CCCCCCCCCC
GGGGG
(dG)n
Figura 24: Principio da RACE.
Para obter as extremidades 3’ (3’RACE), o RNA é retrotranscrito
através de um oligonucleotídio constituído de resíduos dT e de uma
seqüência adaptadora. As amplificações são realizadas através de
um oligonucleotídio derivado do gene de interesse (GSP1, GSP =
gene specific primer) e de um outro complementar ao adaptador.
Uma segunda amplificação é realizada com oligonucleotídios especí-
ficos internos (GSP2) e aquele complementar à seqüência adaptadora.
Utilizando-se a mesma estratégia, pode-se obter a extremidade 5’ (5’RACE).
A retrotranscrição é feita através de um GSP. Uma cauda poli(C) é acres-
centada ao cDNA fita simples. A amplificação é realizada por meio de um
oligonucleotídio poli(G) e de um outro específico GSP1. Uma segunda
amplificação é, então, realizada com um oligonucleotídio complementar
ao adaptador e um outro específico mais interno.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
132
Anexos
Fenótipo
Genotipagem
~20 animais afetados
~80 marcadores
Cromossomos
Mapeamentos à alta
resolução
100-1000 meioses
SSLPs/SNPs
Intervalo com o Gene
Candidato
Sequenciamento
Mutação
Marcadores Mb
A
B
C
D
E
F
G
H
Afetado
Não Afetado
Linhagem 1 Linhagem 2
35,410,613
35,426,474
36,034,000
36,149,287
37,125,950
37,963,422
38,061,429
38,079,638
438 2 1 1 2
73 2 2
A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1D2 D3 E F1 F2
Figura 25: Identificação da mutação.
Assim que uma mutação é isolada (parte de cima da figura, aqui repre-
sentada por um fenótipo afetando a coloração da pelagem), os estudos
genéticos começam através de cruzamentos que gerem recombinantes
que servirão na genotipagem. A genotipagem é realizada através de
marcadores moleculares polimórficos entre as duas linhagens utilizadas no
cruzamento. Geralmente estes marcadores são os microssatélites (SSLPs)
ou SNPs. Este processo leva a identificação do cromossomo portador do
lócus mutado (o esquema apresentado é meramente ilustrativo), geral-
mente determinado num intervalo candidato entre 10 à 20Mb (Mega pares
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
133
Anexos
de bases). O passo seguinte é refinar a região candidata mapeada através
do mapeamento à lata resolução. Para tanto, é preciso aumentar o número
de meioses analisadas, este número pode variar dependendo do número
de marcadores polimórficos disponíveis na região e da densidade gênica
(de 100 a 1000 meioses). Ao final, o intervalo candidato delimitado ficará
entre 1-2 Mb. No exemplo da figura, a mutação recessiva induzida na linha-
gem C57BL/6 foi mapeada à alta resolução usando animais cruzados com a
linhagem 129SvEv. Aqui, 529 animais foram genotipados com 8 marcadores
distribuídos ao longo dos 4,6 Mb que compõem a região candidata e 10 re-
combinantes foram encontrados. Estes animais ou meioses recombinantes
possibilitaram redefinir a região, a qual foi reduzida para 1,8 Mb. Nesta
altura do trabalho, o sequenciamento dos genes candidatos posicionais
pode começar, aqui a mutação apresentada é a transversão da citosina (C)
para a guanina (G).
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
134
Anexos
Marcadores Haplótipos
D13Mit80
D13Mit215
pmn
D13Mit115
D13Mit3
D13Mit16
D13Mit61
D13Mit154t
Números 46 2 1 1 1 2 6 4
Figura 26: Haplótipo.
O esquema representa os haplótipos dos animais obtidos a partir do
retrocruzamento interespecifico entre a linhagem da espécie Mus spretus
e a linhagem de laboratório, na qual o alelo pmn está segregando. Os
DNA desses 63 animais N2 pmn/pmn foram tipados com os marcadores
do tipo microssatélite. Os retângulos brancos indicam que o marcador é
homozigoto para o alelo Mus musculus domesticus (alelo de laboratório
originário do alelo pmn). Os retângulos pretos indicam que o haplótipo
é heterozigoto para os alelos Mus spretus e Mus musculus domesticus.
O número embaixo de cada coluna representa o número total de animais
por haplótipo. O resultado mostra que o lócus pmn se encontra entre os
marcadores D13Mit215 e D13Mit115.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
135
Anexos
X
X
Xt + / + +
Xt + / + pmnXt + / + pmn
+ + / + pmn
[Xt] [pmn] [Xt pmn] [+]
430 211 0 0
F2
F1
P
Número
de animais
Figura 27: Cruzamento intra-especifico.
Nós obtivemos 641 animais provenientes do intercruzamento Xt +/ + pmn,
o que representa 1.282 meioses. Nenhum recombinante foi encontrado.
Esses resultados indicam que o lócus pmn encontra-se a uma distância
compreendida entre O a 1 cM do lócus Xt, com risco de 5% e a uma distância
de O a 1,5cM com risco de 1%. O mesmo tipo de cruzamento foi realizado
entre pmn e pe. Nós obtivemos 116 (232 meioses) animais, a partir do
intercruzamento de animais pe +I + pmn, e encontramos 6 recombinantes
pe pmn/pe pmn. Esse resultado coloca pmn a, aproximadamente, 4 3 cM
do lócus pe.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
136
Anexos
Figura 28: Mutação “Extra-toe” e o estoque balanceado.
Os animais mutantes (+/Xt) representados à esquerda na figura, apresen-
tam um dedo extranumérico visível na pata posterior, porém
ausente na
pata posterior do animal pmn/pmn (à direita). A presença desse marcador
permite identificar os animais homozigotos pmn/pmn desde o nascimento,
pois estes não possuem o dedo extranumérico e também permite elimi-
nar os animais que não são portadores do alelo pmn, pois, nesse caso, a
condição Xt/Xt é letal in utero. O estoque balanceado Xt +1 + pmn é de
grande importância, pois permite o reconhecimento precoce dos animais
que se tornarão doentes.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
137
Anexos
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
D13Mi158
D13Mi80
D13Mit173
D13Mit162
D13Mit207
D13Mit57
D13Mit174
D13Mit206
D13Mit218
D13Mit56
D13Mit215
D13Mit
Gli20
D13Mit305
D13Mit115
D13Mit17
D13Mit3
D13Mit133
D13Mit16
D13Mit154
D13Mit81
D13Mit61
D13Mit10
Msx2
D13Mit13
D13Mit21
S3S5.ex2
Cf2R
D13Mit28
D13Mit47
D13Mit32
Cr. 13
Figura 29: Localização precisa dos marcadores microssatélites no cromos-
somo 13 murino.
Esse mapa foi estabelecido, utilizando-se a coleção de DNA do EUCIB. Os
genes G1i20 (BRUNIALTI et al., 1995), Msx-2 (ROBERT; BRUNIALTI, 1995),
Cf2r (POIRIER et al., 1996) e Smn (S3S5.ex2) (VIOLLET et al., 1997) também
foram localizados nesse mapa.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
138
Anexos
Xt
D13Mit80
D13Mit173
D13Mit154
Gli3
D13Mit3
D13Mit16
D13Mit154
D13Mit218
D13Mit115
D13Mit133
(3,35 +/- 0,57 cM)
(0,8 +/- 0,28 cM)
(0,4 +/- 0,23 cM)
(1,32 +/- 0,36 cM)
(1,82 +/- 0,42 cM)
(2,43 +/- 0,48 cM)
1q
7p
Figura 30: Mapa genético parcal da região cromossômica de interesse.
Mapa genético do cromossomo 13 (parcial) de camundongos indicando a
região onde se encontra o gene pmn (retângulo pontilhado). Esse mapa foi
estabelecido, utilizando-se a coleção de DNA do EUCIB (N=982) e os mar-
cadores moleculares em torno do lócus G1/3. A localização do lócus pmn
foi definida levando-se em conta os resultados apresentados nas figuras 26
e 27. Os retângulos à esquerda da figura indicam as regiões de homologia
entre o cromossomo 13 murino e os cromossomos 1 e 7 humanos.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
139
Anexos
Y
13
.1
15
Y
90
3.
1
Y
90
2.
2
AB1380
16
40
K
b
10
95
K
b
U
R
A
3
en
d
o
g
èn
e
84
0
K
b
Y
13
.1
15
Y
90
3.
1
Y
90
2.
2
AB1380
16
40
-1
09
5-
11
20
-1
13
0
K
b
98
0-
95
0
K
b
68
0
K
b
59
0
K
b
44
0
K
b
35
0
K
b
Figura 31: Análise pela eletroforese em campo pulsado dos YAC Y902.2,
Y903.1 e Y13.115.
Quatro culturas independentes de cada clone foram analisadas. A eletro-
forese em campo pulsado foi realizada em agarose Seake GTG 1%; 0,5 X TBE,
a 190 volts. Os tempos dos pulsos são de 45 segundos durante 24 horas
(foto da esquerda). Após transferência para membrana de Nylon 1\1’ pelo
método de Southern blot, os cromossomos artificiais de levedura foram
revelados pela hibridização de um fragmento do gene URA3 de levedura
(foto da direita). Essa sonda reconhece o gene endógeno e o gene pre-
sente no vetor YAC. AB1380 é uma linhagem de levedura (Saccharomyces
cerevisiae).
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
140
Anexos
49
6K
2
(1
40
K
b
)
Y
13
.3
05
.2
(1
25
0
K
b
)
12
P1
1
(1
00
K
b
)
28
3E
20
(1
60
K
b
)
38
8A
11
(1
40
K
b
)
Y
13
.1
15
.1
(1
64
0
K
b
)
Y.
13
.2
15
(1
20
0
K
b
)
Y.
90
2.
2
(1
09
5
K
b
)Y.
90
3.
1
(8
40
K
b
)
C
r.1
3
D
13
M
it
21
5
p
m
m
G
li3
G
C
K
D
13
M
it
30
5 IN
H
B
AD
13
M
it
11
5
Figura 32: Organização dos YAC.
Esta organização contém os marcadores D13Mit215, D13Mit305 e
D13Mit115 e o gene Gli3 (sondas Glill e G1i20) na forma de um contig. Os
traços descontínuos correspondem às regiões quiméricas. Os BAC obtidos
a partir dos marcadores D13Mit215 (388A11), G1i20 (283E20), Glill (12P11)
e D13Mit115 (496K2) estão igualmente representados embaixo da figura.
Os marcadores GCK e INHBA são dois genes humanos que nós localizamos
pela PCR nos YAC.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
141
Anexos
Y902.2
Y13.115
Y13.215
Y13.305
AB1380
Y903.1
Figura 33: Análise por Southern blot da extremidade esquerda do clone
Y902.2.
Os cromossomos de levedura foram separados pela eletroforese em um gel
de agarose Seaken GTG 1%;0,5 X TBE a 9°C, a 190 volts. Os tempos dos pulsos
foram de 45 segundos durante 24 horas. O DNA foi, então, transferido e
fixado sobre uma membrana de nylon N+. A membrana foi hibridizada com
um fragmento de DNA marcado com radioatividade e que correspondia à
extremidade esquerda do YAC Y902.2. Na figura, pode-se ver que esse frag-
mento está presente nos clones Y903.1, Y13.305.2 e reconhece também
o DNA do clone do qual foi isolado. AB1380 é uma linhagem de levedura
(Saccharomyces cerevisiae).
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
142
Anexos
CpG
CpG
CpG
Gli3
I
D13Mit305
D
D
D
G
G
GY13.305.2
Y903.1
Y902.2
100 Kb
M M
M
M
NN N N
N
N NE E E E E EEE
B
B
S
S
R R R
R
R
Sa Sa
Figura 34: Mapa de restrição do contig de YAC que cobre a região pmn.
D e G representam as extremidades direita (lado URA3 do vetor pYAC4) e
esquerda (lado TRP do vetor pYAC4), respectivamente. Os círculos cheios
correspondem às extremidades dos clones provenientes da região pmn. Os
círculos vazios correspondem às extremidades quiméricas (a extensão da
região quimérica está representada pelas linhas pontilhadas). As ilhas CpG,
definidas pelo agrupamento de 3 ou mais enzimas de restrição que cortam
raramente o genoma, estão igualmente representadas. B: BssHII, E: Eagl,
M: Mlul, N: Notl, R: Nru, S: Sall, Sa: Sacll, SM: Smal.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
143
Anexos
100 Kb
D
G
Y13.305.2
Y903.1
Y902.2
M M
M
M
NN N N
N
N NE E E E E EEE
B
B
S
S
R R R
R
R
Sa Sa
D G
283E20
12P11
496K2
D G
E1
E2
CL9
CL14
CL30
CL34
Gli3
E13
CL10
CL20
D13Mit305
D13Mit115
E3
E11 E7 E10
Figura 35: Localização dos éxons e das ESTs.
Localização dos fragmentos dos genes isolados pela técnica da amplifica-
ção dos éxons internos (CL) e localização das EST humanas (E) no mapa de
restrição do contig de YAC e BAC.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
144
Anexos
E7 E2
Xt pmn Xt pmn+ +B6 B6H
2O
H
2OM
220 pb 317 pb
Figura 36: Análise pela PCR das EST humanas E7 (A006127) e E2
(WL9635).
O cDNA dos animais de fenótipo Xt, pmn e selvagem (+) foram testados para
cada conjunto de oligonucleotídios. O DNA genômico da linhagem C57BL/6
e água foram utilizados para o controle da amplificação. O DNA genômico
não foi amplificado com os oligonucleotídios provenientes da EST E7. Esse
resultado indica a existência de seqüência intrônica entre os oligonucle-
otídios, o que, provavelmente, tornou a amplificação impossível. Já para
a EST E2, foi obtido um produto de amplificação para o DNA genômico,
indicando a inexistência de um íntron entre os oligonucleotídios. Não foi
encontrada diferença de tamanho do produto amplificado entre os animais
Xt, pmn e +. (M) Marcador de peso molecular 100pb Ladder (Pharmacia).
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
145
Anexos
E
E
E
E
T
T T
T
T
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
PCR
1
1
1
4
4
3
3
3
3
5
5
2
2
2
P
P P
P
P
E
E
E E
E
E
E
E
H
HH
H
H
Ligação Ligação
Ligação
Taql TaqlEcoRl
EcoRl
Pstl
Hindlll HindlllPstl
TEL TRP1 ARS1 CEN4 SUP4
Figura 37: Isolamento das extremidades do YAC através da PCR inversa.
O DNA do YAC foi digerido por uma enzima cujo sítio de restrição está pre-
sente no vetor. O DNA digerido foi, em seguida, religado sobre si mesmo.
Entre as moléculas circulares, algumas possuem um fragmento do vetor
flanqueando uma extremidade do YAC. Utiliza-se, em seguida, iniciadores
específicos do vetor para amplificar a extremidade do YAC.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
146
Anexos
mRNA
cDNA
PCR
PCR
Retrotranscrição
Extração do RNA citoplasmático
Transfecção dos mRNA
Emenda
Tranfecção em célular de mamíferos
éxon éxoníntron
SA
SA
SD
SD
Vetor de expressão
sítio de poliadenilação
Fragmento genômico contendo um éxon
AAAAAAAAAAA
= éxon cerdado pelas
seqüências do vetor
Figura 38: Principio da amplificação dos éxons internos ou Éxon-
Trapping.
Legenda detalhada na Figura 22.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
147
Anexos
éxon éxon
5000
Eamll051l
4958
Bsa
4891
Fsp l
4738
Pvu l
4591
Bcg l
4436
BsaHl 4422
X mm l 4359
4000
Xcm l 3906
Apa l 3774
Hpa l 3395
SAv 3095
Msc l 3231
3000
EcoNl 2348
2000
Nhel 1976
Sítio de clonagem múltipla
N de l 11191000
Blos l
862
Sal
687
689SDv
Xba I 681
BsaA I IEco 721674
Esp I641
Avt II 324
Sfr I270
6000
on
Drd I 5743 Hae II 5607
BspH I 5131
Cfno I 4878
Bgl I 4839
Ap
BspH I 4123
Ban II 3774
Mun I 3406
Mam I 3494
Aval 3107
Hind III 2857
Dra III 2815
Mun I 2371
Mam I 2271
Ava I 1023
Cfno I 1157
Pvu III 1799Stu I1548
Dra III
1311
Ban II
1020Acc I 687
Acc 485
Dsal IN oo I
491Hind III 340
Slu I321
Bgl I271
Dsa I IN co I
231
Sph I 140
Sph I 68
Pvu II 1HaeII
5977
pSPL3
603 1 bp
Bstx I
Meio-sítio
698
Sdv
Sítio de
clonagem
Múltipla
Sdc
1134
Bstx I
Half-site
3095
Sav
3245-3265
Sa2
dUSA 4
3178-3199
10561009
dUSD 2
654-671
Sv40
P
607-626
Sd6
EcoR I
Bstx I
Sst I
Xho I Xma III Pst I
BanH I EcoR v
CCAGAATTCTGGAGCTCGAGCGGCCGCTGCAGGATCCCAGATATCTGG
Bstx I
Figura 39: O vetor de expressão pSPL3.
A parte superior do esquema representa os íntrons e éxons do gene tat do
HIV-1, tendo nas bordas as seqüências exônicas da B-globina. P = promotor
SV40; SDv = sítio doador de emenda; SDc = sítio críptico de emenda; e SDa
= sítio aceptor de emenda. Os oligonucleotídios utilizados na PCR também
estão indicados. A parte inferior da figura representa o mapa circular do
plasmídio.
Para voltar à leitura, clique sobre a figura.
Anexos
Doenças Humanas Mapeamento Referência Modelo animal
(camundongo) ou
gene homólogo
Mapeamento Referência
Musculatura
Miotroﬁa espinal
distal
7p Hum. Mol. Genet.,
1995, 4:1629-32
Miotroﬁa espinal
(Tipos 1, 2 e 3)
5q11-q13 Cell, 1995, 80:155-
165
Smn 13 Genomics, 1997,
Distroﬁa muscular
(SCARMD)
17q12-q21.33 Cell, 1994, 78:10-20
Distroﬁa muscular
congenital à merosina
negativa
6q22-q23 Hum. Mol. Genet.,
1994, 3:1657-61
mutante distroﬁa
muscular (dy)
10 J.Bio.Chem., 1994,
269:13729-32
Distroﬁa muscular de
cinturas (LGMD2B)
2p Genomics, 1995,
27:192-95
Distroﬁa muscular de
cinturas (LGMD2A)
15q15.1-q15.3 Cell, 1995, 81:1-20 calpaína 3 (Canp3) 3 ou 4 Mamm. Genome,
1996, 7:377-379
Distroﬁa muscular de
cinturas (LGMD1A)
5q Am.J.Hum. Genet.,
1992, 50: 1211
Distroﬁa muscular
fácio-escápulo-
humeral
4q35 Lancet, 1990: 336-
365
Distroﬁa muscular
óculofaringeal
14q1 1.2-q13 Hum.Mol.Genet.,
1995, 4: 429-434
Distroﬁa muscular de
Duchenne
Xp21.2 Nature, 1992,
300:6971
muscular dystrophy
(mdx)
X EMBO J., 1988,
7:3017-3021
Miopatia distal
autossômica
dominante
14q Am.J.Hum. Genet.,
1995, 50:422-427
Síndrome de
Schwartz-Jampel
1p34-p36.1 Hum.Mol.Genet.,
1995, 4:1633-36
Sistema nervoso
Adrenoleucodistroﬁa Xq28 Nature, 1993:726-730 adenocortica lipid
depletion (ald)
1 Acta Pathol.
Microbiol. Scan.,
1963, 58:212-218
Ataxia cerebelosa
periódica familiar
19p13 Am.J.Hum.Genet.,
1995, 56:1443-1449
Ataxia de Friedreich
com déﬁt isolado em
vitamina E
8q Nature Genetics,
1995, 9:141-145
Ataxia espino-
cerebelosa
autossômica
dominante (SCA2)
12q23-24.1 Genomics, 1995,
25:433-435
Ataxia espino-
cerebelosa
autossômica
dominante (SCA3)
14q24.3-q32.2 Am.J.Hum.Genet.,
1995, 56:193-201
Ataxia espino-
cerebelosa
autossômica
dominante (SCA5)
11cen Nature Genetics,
1994, 8:280-284
Ataxia espino-
cerebelosa com início
na infância (IOSCA)
10q23.3-q24.1 Am.J.Hum.Genet.,
1995, 56:1088-1095
Ataxia espino-
cerebelosa do tipo I
(SCAI)
6p22-p23 Nature Genetics,
1993, 4:221
ScadI 13 Genomics, 1992,
12:818-821
Epilepsia noturna
frontal autossômica
dominante
20q13.2 Nature Genetics,
1995, 10:117-118
Acra4 2 Am.J.Hum.Genet.,
1995, 56:289-293
Hidrocefalia ligada ao
cromossomo X
Xq28 HGM, 1991, 11,
Abstract:234
Doença de Alzheimer
familiar
1q31-42 Science, 1995,
269:970-977
camundongo
transgênico
Nature Genetics,
1995, 9:21-30
Doença de Alzheimer
precoce (locus AD3)
14q24.3-q32.2 Hum.Mol.Genet.,
1995, 4:1355-1364
Doença de Charcot-
Marie-Tooth tipo 1A
17p11.2 HGM, 1991, 11,
Abstract:12
mutante trembler
(Tr)
11 PNAS, 1992,
89:4382-6
Doença de Charcot-
Marie-Tooth tipo 2
1p35-p36 Am.J.Hum.Genet.,
1995, 57:853-858
Doença de Charcot-
Marie-Tooth tipo 4A
8q13-21.1 Mol.Genet., 1993,
2:1625-1628
Doença de Machado-
Joseph
14q24.3-q32.2 J.Med.Genet., 1995,
32:25-31
Malformações
cavernosas do cérebro
7q Genomics, 1995,
28:311-314
Neuroﬁbromatose do
tipo 2
22q12 Nature, 1993,
363:515-521
Neuropatia axonal
moto-sensorial
Xq24-q26 Genomics, 1995,
29:409-412
Paraplegia
espasmódica
familiar autossômica
dominante
14q Am.J.Hum.Genet.,
1995, 56:183-187
Retardo mental ligado
ao X
Xp22 Am.J.Hum.Genet.,
1994: 581-585
Esclerose lateral
miotróﬁca juvenil
recessiva
2q33-q35 Nature Genetics,
1994, 7:425-428
Síndroeme de Cohen 8q Nature Genetics,
1994, 7:201-204
Síndroeme de
Kallmann
Xp22.3 Cell, 1991, 67:423-
435
Síndrome do X frágil Xq27-q28 Am.J.Hum.Genet.,
1991, 38:336-342
camundongo
transgênico (Fmr-1)
X Genomics, 1992,
12:818-821
Tabela 1.
ANEXO II- TABELAS
Para voltar à leitura, clique sobre a tabela.
Anexos
Mutação Símbolo Cromossomo Modo de transmissão
arrested development of righting response adr 14 recessiva
agitans ag 18 recessiva
ataxia ax 18 recessiva
bouncy bc 18 recessiva
cribriform degeneration cri 4 recessiva
dystonia musculorum dt 1 recessiva
ducky du 9 recessiva
dystrophia muscularis dy 10 recessiva
gracile axonal dystrophy gad 5 recessiva
gray tremor gt 5 recessiva
hotffot ho 6 recessiva
jimpy jp X recessiva
jittery ji 10 recessiva
lethargic lh 2 recessiva
lumbosacral neuroaxonal dystrophy lnd 7 recessiva
Lurcher Lc 6 semidominante
motor neuron degeneration mnd 8 recessiva
motor neuron degeneration 2 mnd2 6 recessiva
motor end plate desease med 15 recessiva
muscle deﬁcient mdf 19 recessiva
muscular dystrophy with myositis mdm 2 recessiva
X-linked muscular dystrophy mdx X recessiva
myodystrophy myd (fg) 8 recessiva
opisthotonos opt 6 recessiva
progressive motor neuronopathy pmn 13 recessiva
quaking qk 17 recessiva
quivering qv 7 recessiva
shiverer shi 18 recessiva
spastic spa 3 recessiva
staggerer sg 9 recessiva
swaying sw 15 recessiva
tipsy ti 11 recessiva
tippy tip 9 recessiva
tottering tg 8 recessiva
Trembler Tr 11 recessiva
Trembly-like Tyl X semidominante
twitcher twi 12 recessiva
vibrator vb 11 recessiva
wabbler-lethal wl 14 recessiva
wasted wst 2 recessiva
weaver wv 16 recessiva
wobbler wr 11 recessiva
Tabela 2.
Sites na Internet Comentários
Genética de camundongos
www.informatics.jax.org/mgihome/ Mouse Genome Informatics é o centro de bioinformática do
Jackson Laboratory,
Maine (USA).
São encontrados dados sobre a genética, genômica e biologia
dos camundongos de
laboratório.
Análise do genoma do camundongo
http://www.ensembl.org/Mus_musculus/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/mouse/
http://www.genome.ucsc.edu/
Todos os três sites oferecem banco de dados hierárquico da
sequência murina.
Centros de mutgênenese e descrições de mutantes
http://www.mgu.har.mrc.ac.uk/mutabase/
http://www.gsf.de/ieg/groups/enu-mouse.html
Todos os sites apresentam o fenótipo dos mutantes obtidos
nos centros de pesquisa:
Harwell (Inglaterra)
Munique (Alemanha)
Informação sobre a expressão dos genes
http://bodymap.ims.u-tokyo.ac.jp/ Banco de dados que apresenta a expressão dos genes
humanos e dos camundongos.
Embriologia e anatomia patológica dos camundongos
http://genex.hgu.mrc.ac.uk/
http://www.med.unc.edu/embryo_images/
Site apresenta um atlas tridimensional do desenvolvimento
embrionário do camundongo,
bem como o perﬁl de expressão dos genes ao longo da
embriogênese.
Site apresenta imagens de microscopia eletrônica de
camundongos normais e mutantes.
Tabela 3.
Para voltar à leitura, clique sobre a tabela.
Anexos
Número de sítios/ilhab
Grupo Número de
CpG
Conteúdo
de G+C
Enzimasa Sítio Esperado Observado Estimativa de todas os
sítios na ilhas
I 2 8/8 NotI GCGGCCGC 0.14 0.35 93
AscI GGCGCGCC 0.14 0.27
II 2 6/6 BssHII GCGCGC 1.68 2.11 76
EagI CGGCCG 1.68 1.17
SstII/SacII CCGCGG 1.68 1.89
III 1 6/6 NaeI GCCGGC 1.68 1.14 41
NarI GGCGCC 1.68 1.65
SmaI CCCGGG 1.68 2.14
IV 2 4/6 MluI ACGCGT 0.42 0.03 4
NruI TCGCGA 0.42 0.11
PvuI CGATCG 0.42 0.08
SplI CGTACG 0.42 0.03
Vc 1 4/6 SalI GTCGAC 0.42 0.14 5
XhoI CTCGAG 0.42 0.43
VI HhaI GCGC 46.2 21.86 26
HpaI CCGG 46.2 20.35
a Todas as enzimas listadas são bloqueadas pela metilação.
b O tamanho médio assumido para as ilhas é de 1.4 Kb. Esta estimativa é baseada nas 37 primeiras ilhas
CpG descritas em humanos.
c Existe várias enzimas neste grupo, porém aqui estão listadas as mais comuns.
Tabela 4.
Tabela 5. Clones de YAC utilizados na construção do contig.
Lócus YAC Tamanho em Kb
D13mit215 Y13.215 1000
GLI20 Y902.2 1095
Gli11 Y903.1 1000
D13Mit305 Y13.305.2 1200
D13Mit115 Y3.115.1 1640
Tabela 6. Clones de BAC utilizados na procura de seqüências codificadoras.
Lócus BAC Tamanho em Kb
D13Mit215 388A11 140
Gli20 282K20 160
Gli11 12P11 100
D13Mit115 496K2 140
Tabela 7.
Clone Origem Tamanho
(pb)
Localização
nos YAC/
BAC
RT-PCR Homologia Número de Acesso
(Genebank)
CL25 AEI, BAC
282E20
350 pb nenhuma positiva gene Fabpi
(exons 1-4)
M65033
CL9 AEI, BAC
282E20
300 pb Y902.2;
283E20
negativa cDNA
humano
AA029228
CL10 AEI, BAC
12P11
150 pb Y903.1;
Y13.305.2;
12P11
positiva nenhuma
homologia
CL12 AEI, BAC
282E20
400 pb nenhuma positiva proteína
tirosina cinase
P42685
CL14 AEI, BAC
12P11
200 pb Y902.2;
283E20
positiva EST humana F12060 (clone
c-35c03)
CL20 AEI, BAC
12P11
500 pb Y903.1;
Y13.305.2;
12P11
positiva EST humana R60817 (clone
42061)
CL30 AEI, BAC
282E20
330 pb Y902.1;
283E20
positiva nenhuma
homologia
CL34 AEI, BAC
282E20
310 pb Y902.1;
283E20
positiva EST rato H32240 (EST107143)
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Anexos
EST Iniciadores para a PCR Tamanho produto
de PCR (pb)
Localização nos
YAC/ BAC
RT-PCR
stSG1827 (E1) 1.ACTGGCTGCTCTTGTCTTGGT
2.CCTCTTCTGACCTGCTTTG
149 pb Y902.2 positiva
WI.9635 (E2) 1.GTGCTTGGTGTGGTTGTGG
2.AAGGAGCTGGAATAGCTTTGC
317 pb Y902.2 positiva
WI.11127 (E3) 1.CTCACGACTGTTCTGGAAAGG
2.CCCACAAATAAAAAGCAAGTTG
179 pb Y903.1; Y13.305.2 positiva
WI.6721 (E4) 1.TGAGGCATTATCAGGAAATGC
2.ATGCTCAGCAGTACAAAATAGATCC
107 pb nenhuma negativa
WI.8128 (E5) 1.CGACTCCACCTCCAAACTGT
2.GATGCATTTCCCCCACATAC
133 pb nenhuma negativa
WI.9547 (E6) 1.AACCCAGTTTTCCAGCCAC
2.AATTCTGATTCCTTTTATCATGTGC
201 pb nenhuma negativa
A006I27 (E7) 1.AGTTAGTCATAGGAGACAGT
2.CCTTGTACTGTTGTTATACA
220 pb Y13.115.1; Y903.1 positiva
A006J31 (E8) 1.AACAGACCTCTAGGGTTC
2.GTACATTAAGACATTGAATG
206 pb nenhuma negativa
SHGC.8675 (E9) 1.TCAGGCGGTTCAAGGCAG
2.GTGTCCATCATCAGGGGAAG
178 pb nenhuma negativa
SHGC.5634 (E10) 1.GGAGCTGAGCACATTGTGG
2.ATTCTGTTGTCAAGGGGCAAG
160 pb Y13.115.1; 496K2 positiva
WI.16185 (E11) 1.GGGTCACTTGGCCTCTTCTA
2.TTTGCAGTCAGGACAAGCCT
107 pb Y903.1; Y13.305.2 positiva
WI.6581 (E12) 1.AGCCCTCCTGAGGTTGTTG
2.GGGGCAGCTAAAATTTTTATTC
205 pb nenhuma positiva
stG3118 (E13) 1.GAGTTGGTGCCAGATGGG
2.TTTAAATGTTGGCTCCCTGG
158 pb 12P11 positiva
stG4037 (E14) 1.TGCAAGGACAGCAGAGGAC
2.TGGGGCCAGTTAGAAGAGG
123 pb nenhuma negativa
stG4087 (E15) ATGTATCCATTTCAAAGGCCC
2.GCCATGTTAAAATAGGAGTGCC
138 pb nenhuma negativa
Tabela 8.
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