Estudodirigido-2012 (3)

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Instituto de Ciências Biomédicas
Departamento de Bioquímica Médica - CCS- Bloco B- 1o andar.
Faculdade de Farmácia
Disciplina : Bioquímica II
Bloco I
Professores: Ana Paula Valente 
Professor responsável: Ana Paula Valente
Bloco K, CNRMN
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_______________________________________________________________________________________________
ESTUDO DIRIGIDO I 
GLICÓLISE
HISTÓRICO
Louis Pasteur, em 1861, publicou a descoberta histórica de que o crescimento de leveduras, por grama de glicose, é maior na presença de ar do que na ausência de ar. Esta foi a primeira demonstração de que o mecanismo de glicólise aeróbica é mais eficiente do que o da glicólise anaeróbica. Pasteur também observou que a glicose é consumida mais lentamente na presença de ar do que em condições anaeróbicas. Esse efeito conhecido como "efeito Pasteur" constituiu-se num enigma para os bioquímicos durante muitos anos, que elaboraram as mais diferentes hipóteses para este fenômeno.
Você pode imaginar uma hipótese que explique o efeito Pasteur?
2) É enorme a dívida mundial com o gênio que foi Pasteur. Na época de Pasteur (1822-1895), duas teorias tentavam explicar a conversão de glicose em seus produtos de degradação (fermentação): a teoria dos "germes" (fermentação causada por microorganismos) ou a teoria da geração espontânea (fermentação gerada por degradação química). Iniciando seus estudos sobre a produção de vinho, vinagre ( produtos da fermentação de glicose) observou que os compostos obtidos frequentemente continham produtos oticamente ativos. Quando Pasteur iniciou seus trabalhos como químico havia estudado a molécula de tartarato, que possuía isômeros óticamente ativos e estabeleceu que a atividade ótica estava relacionada com "vida”. Sendo assim, convenceu-se que a fermentação ocorreria na presença de microorganismos vivos. Propondo que cada processo fermentativo poderia ser atribuído a um microorganismo específico, Pasteur dirigiu sua atenção ao isolamento e ao estudo das necessidades nutricionais dos microorganismos empregados amplamente até então na fermentação industrial.
Enfim, Pasteur lançou a “teoria vitalista” que dizia que “a fermentação só ocorre na presença de microorganismos vivos”, e que foi aceita pela comunidade científica por muitos anos. 
Você acredita na "teoria vitalista"? Como você provaria (ou não) esta teoria?
Dois irmãos (os irmãos Buchner) foram despedidos de um famoso laboratório de química, dado à sua "total incapacidade para o trabalho científico". Ao tentarem fabricar um medicamento à base de suco concentrado de levedura (que era muito utilizado para o tratamento de doenças pulmonares), os irmãos Buchner cresceram grandes quantidades de levedura, que passaram em prensas para concentrar e esterilizar, matando os microorganismos. Na tentativa de preservar e melhorar o sabor, os irmãos Buchner acrescentaram açúcar, um conhecido conservante para doces. Para sua surpresa a fermentação foi imediata, muito maior que a observada com os microorganismos vivos. 
Você pode explicar a experiência dos irmãos Buchner à luz da "teoria vitalista"? 
E com os conhecimentos de nossa época? 
Um dos "inábeis" irmãos Buchner continuou trabalhando em química e ganhou o prêmio Nobel alguns anos após.
OS PASSOS DE DEGRADAÇÃO DE GLICOSE
4) Harden e Young, em 1909, isolaram o primeiro intermediário da via glicolítica, utilizando para este estudo o mesmo "suco de levedura" pelos irmãos Buchner. Em condições de anaerobiose, o suco de levedura transforma glicose em álcool e CO2. Harden e Young observaram uma estranha ativação pelo suco de levedura fervido e tentaram identificar esse ativador. Para tal, realizaram o conjunto de experiências abaixo:
a) Tabela I:
Efeito da adição de suco de levedura fervido na fermentação total de glicose por suco de levedura.
	Suco (mL)
	Água (mL)
	Suco fervido (mL)
	Glicose (g)
	Tempo (h)
	CO2 formado (g)
	25
	25
	-
	5
	70
	0.246
	25
	-
	25
	5
	70
	0.356
	25
	50
	-
	7.5
	70
	0.180
	25
	-
	50
	7.5
	70
	0.431
	25
	75
	-
	10
	70
	0.141
	25
	-
	75
	10
	70
	0.515
Qual o efeito da adição de suco fervido na fermentação?
b) Tabela II:
Diálise de suco de levedura fervido
	Experimento
	Água (mL)
	Suco fervido (mL)
	Resíduo (mL)
	Dialisado (mL)
	Tempo (h)
	CO2 formado(g)
	1
	25
	-
	-
	-
	48
	0.268
	
	-
	25
	-
	-
	48
	0.497
	
	-
	-
	25
	-
	48
	0.276
	
	25
	-
	-
	-
	72
	0.113
	2
	-
	25
	-
	-
	72
	0.334
	
	-
	-
	25
	-
	72
	0.189
	
	-
	-
	-
	25
	72
	0.334
	3
	25
	-
	-
	-
	48
	0.154
	
	-
	-
	-
	25
	48
	0.251
OBS:Todos os tubos continham 25 mL de suco não fervido + 5g de glicose + tolueno (conservante). No experimento 3, o suco de levedura foi dialisado antes de ser fervido.
O que a diálise está separando?
Qual componente tem atividade?
Qual o objetivo do experimento 3 da tabela II?
Quais são as características do ativador que você conhece até agora?
Qual seria o próximo passo para descobrir o ativador?
c) Tabela III:
	Equivalência de CO2 extra formado durante o período inicial, e fosfato adicionado.
	Experimentos
	CO2 (g) observado
	CO2 (g) calculado a partir do fosfato
	Experimentos
	CO2 (g) observado
	CO2 (g) calculado a partir do fosfato
	1
	0.090
	0.086
	8
	0.196
	0.197
	2
	0.054
	0.055
	9
	0.066
	0.065
	3
	0.058
	0.051
	10
	0.057
	0.061
	4
	0.060
	0.049
	11
	0.056
	0.061
	5
	0.106
	0.112
	12
	0.059
	0.061
	6
	0.103
	0.101
	13
	0.068
	0.070
	7
	0.113
	0.112
	14
	0.071
	0.070
OBS:
Nos experimentos 1 a 7 foi adicionado suco de levedura fervido. A quantidade de Pi presente no suco foi estimada por precipitação com citrato de magnésio e o CO2 esperado ser produzido foi calculado a partir do Pi estimado. Nos experimentos 8 a 14 foi adicionado fosfato de potássio.
d) Na tabela IV, abaixo, 25 mL de suco de levedura foram utilizados e a tabela refere-se ao fosfato determinado.
Em (A): Água quente foi adicionada à 25 mL de suco de levedura. A mistura foi fervida, filtrada e o coagulado foi lavado antes da determinação de fosfato.
Em (B): Ao suco de levedura (25 mL) foram adicionados uma solução 30% de glicose + 0.372 g de fosfato de magnésio. A mistura foi imediatamente fervida, filtrada e o coagulado foi lavado.
Em (C): Como em (B), mas a mistura foi permitida fermentar durante 60 minutos. Após esse tempo, a mistura foi fervida, filtrada e o coagulado lavado.
O fósforo total foi medido após hidrólise ácida por precipitação com citrato de Mg na presença de excesso de amônia.
	
	A
Suco original
	B
Suco + fosfato
não fermentado
	C
Suco + fosfato
Fermentado
	Coagulado
	0.053
	0.057
	0.072
	Filtrado
a) Precipitado por citrato de Mg
	0.126
	0.480
	0.070
	Filtrado 
b) Não precipitado por citrato de Mg
	0.271
	0.282
	0.679
	Total
	0.450
	0.819
	0.821
e) Analise as tabelas acima e interprete os resultados. 
Qual o ativador descoberto por Harden e Young? 
O que está acontecendo com o Pi? 
Você saberia propôr um destino para glicose?
Harden e Young chegaram as seguintes conclusões:
Em presença de suprimento amplo de Pi a fermentação alcoólica da glicose pelo extrato de levedura procede até que toda glicose seja consumida
Em condições onde a quantidade de Pi é limitada a fermentação se torna mais lenta e a Frutose-1,6-bifosfato acumula. 
Por que? 
Onde o Pi participa?
Adição de pequenas quantidades de Pi ao extrato de levedura com limitação de Pi causa um rápido aumento da taxa de fermentação durante a qual 1 mol de CO2 é produzido por mol de Pi adicionado.
f) Em 1928, a estrutura química do composto não precipitado por citrato de Mg foi identificada no laboratório de Levine e Raymond como correspondendo à frutose 1-6 bifosfato; o primeiro intermediário isoladode uma via metabólica. Proponha como seria esta via metabólica com base nos dados obtidos até então.
5) Por volta de 1930, O. Meyerhof lançou uma metodologia de isolamento de enzimas, notadamente as da via glicolítica. Esse pesquisador verificou que o extrato cetônico de músculo de coelho era capaz de utilizar glicogênio com mais facilidade do que utilizava glicose. A situação se modificava na presença de um "ativador" obtido de levedura, conforme figura abaixo. 
Utilização de glicose e glicogênio pelo pó de acetona envelhecido por três semanas
 EMBED Microsoft Excel Chart ��
b) O ativador foi obtido por autólise de levedura na presença de pequenas quantidades de tolueno e precipitado por álcool. O ativador é insolúvel em álcool, solúvel em água, perde a atividade se aquecido por 1 minuto a 50 ºC, é inativado por álcali ou ácido e conserva-se bem em gelo. Você pode imaginar a natureza desse ativador? Para você é espantoso que se obtenha um ativador de músculo de coelho a partir de levedura?
c) Num segundo experimento, o extrato do músculo de coelho e o ativador foram separados por um filme de colóide e glicose foi adicionada. Observou-se um aumento da velocidade de formação de ácido lático. Um aumento de velocidade também era observado quando glicose era adicionada a uma solução de ativador. Após alguns minutos os compostos eram separados por ultrafiltração e o filtrado adicionado ao extrato de músculo. Você pode agora dar um nome ao "ativador" ?
d) Agora analise o gráfico abaixo retirado do trabalho de O. Meyerhof. Que conclusões pode chegar a respeito dos caminhos de degradação de glicose no músculo de coelho e no suco de levedura?.
	Metabolismo de 2mg de glicose pelo extrato de músculo com hexocinase.
e) Finalmente, observe no seu livro o processo de degradação de glicogênio. Você pode dizer porque glicogênio era utilizado pelo extrato cetônico de músculo de coelho mais rapidamente do que glicose?
6) Entre 1940 e 1950, principalmente nos laboratórios de Warburg, Meyerhof e Cori, as várias enzimas da via glicolítica foram purificadas e isoladas (a maioria delas na forma cristalina) e seus modos de ação extensivamente investigados. Da mesma maneira os diferentes intermediários foram sendo isolados com o uso de inibidores. Olhe agora para a rota da glicólise em seus livros. O inibidor não fisiológico, fluoreto, inibe a enzima enolase, enquanto o iodoacetato inibe a gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase. Proponha quais seriam os novos intermediários mais prováveis de serem isolados após a inibição por iodoacetato e por fluoreto.
7) Nós já vimos que na rota da glicólise existem reações reversíveis e irreversíveis. A regulação da velocidade da via é exercida sobre as enzimas que catalisam reações irreversíveis. Você saberia explicar uma vantagem fisiológica desse fato? Uma enzima chave no controle da velocidade da via glicolítica é a fosfofrutoquinase. Essa enzima é ativada por baixas concentrações de ATP e inibida por altas concentrações de ATP que diminuem a sua afinidade pelo seu substrato,ou seja, a frutose-6-fosfato. Altas concentrações de AMP e citrato tambem influenciam a velocidade dessa enzima. Você pode propor se seriam inibidores ou ativadores? Qual o sentido fisiológico dessas regulações?
8) 71 anos apos o isolamento da frutose 1-6 difosfato, uma segunda molécula de frutose difosfato foi isolada de células de hepatócitos. Foi verificado que células de hepatócitos incubadas com glucagon tinham a atividade da fosfofrutoquinase fortemente inibida. A enzima isolada em tubo de ensaio apresentava propriedades normais. Do extrato controle de células de hepatócitos, na ausência de glucagon, foi isolado um composto, caracterizado como frutose 2-6 difosfato, que tinha o seguinte efeito na fosfofrutoquinase isolada de fígado.
a) Efeito da Fru-2,6-P2 na (a) afinidade da PFK para Fru 6-P e (b) na inibição da enzima por ATP.
Analise a figura. Qual o efeito da frutose 2-6 difosfato na velocidade da via glicolítica? Qual o efeito de glucagon no fígado?
9) A concentração de frutose 2-6 difosfato na célula de fígado está na faixa de micromolar. Esta concentração é mais baixa no fígado de ratos diabéticos. O composto é formado a partir de ATP e frutose 6 fosfato por uma enzima denominada fosfofrutoquinase 2.
ATP + Fru-6-P 
 ADP + Fru 2-6 P2
PFK2
ATP + Fru-6-P 
 ADP + Fru 2-6 P2
						FBF2
Pi e AMP influenciam essa enzima. Que efeito você esperaria de Pi e AMP sobre a velocidade da fosfofrutoquinase 2 (PFK2)? 
A frutose 2-6 difosfato é hidrolisada a frutose 6 P pela enzima frutose 2-6 bifosfatase. Incubando fatias de fígado com glucagon, que efeito você esperaria do glucagon sobre a atividade de PFK2 e de frutose 2-6 bifosfatase? Porque a concentração de frutose 2-6 difosfato é baixa em ratos diabéticos?
10) Discuta os destinos do ácido pirúvico em condições de aerobiose e anaerobiose. Em que condições haverá maior rendimento energético? Agora, à luz dos conhecimentos atuais, explique o efeito Pasteur. Explique tambem o acúmulo de frutose 1-6 difosfato nas condições experimentais utilizadas por Harden e Young.
11) Alguns organismos respondem à anoxia segundo um mecanismo adaptativo alternativo ao efeito Pasteur. Esses organismos, por não poderem acumular quantidades elevadas de ácido lático (produto tóxico), respondem à anoxia diminuindo as suas taxas metabólicas. Observe a tabela abaixo. Você pode explicar o mecanismo molecular das regulações envolvidas? Qual o regulador alostérico mais potente da via glicolítica?
a) Tabela 1:
Concentrações de alguns metabólicos em cérebro de camundongo durante isquemia e músculo adutor Mytilus edulis durante anóxia.
Valores estão expressos em nmol/ g peso molhado
			 Cérebro de camundongo			Adutor
	Metabólitos
	Controle
	25 s de isquemia
	Controle
	45 min anóxia
	Glicose 6-P
	224
	91
	110
	170
	Frutose 6-P
	50
	27
	23
	35
	Frutose -1,6-P2
	27
	153
	42
	30
	Dihidroxicetona-P
	13
	39
	35
	30
	P-enolpiruvato
	3.5
	8.5
	13
	10
	Piruvato
	39
	72
	10
	4
	Lactato
	770
	1820
	90
	175
	ATP
	2580
	2410
	4400
	3500
	ADP
	690
	730
	650
	1050
	AMP
	130
	130
	50
	200
	Fosfagênio
	3740
	2000
	2400
	2000
	Pi
	3350
	4410
	850
	1650
Obs: Fosfagênio é a creatina-P no cérebro de camundongo e arginina-P no adutor M. edulis. 
12) Vocês já viram que músculos produzem ácido lático cuja quantidade aumenta no músculo em movimento. Qual o destino metabólico do ácido lático produzido no músculo?
CASO CLÍNICO:
A) Paciente: 18 anos, sexo masculino, aparentemente robusto.
Queixas principais: náuseas, dores musculares, caimbras e alteração da cor da urina após o exercício.
História patológica pregressa e familiar: irmão, irmã e apis mormais.
Pais sem consangüinidade.
Intolerância ao exercício desde sempre.
Teste preliminares:
- Paciente em repouso:
	Dosagem sérica
	Paciente
	Normal
	Hb (g%)
	15
	17
	SGOT (U/mL)
	70
	40
	Aldolase (U/mL)
	52
	3
	CPK (U/mL)
	46
	12
	LDH (U/mL)
	520
	200
- Teste de exercício isquêmico do antebraço: interrompe-se a circulação sanguínea através de um manguito de borracha e paciente deve apertar uma pequena bola durante um minuto. Após isso, coleta-se o sangue de uma veia da mão.
	
	Paciente
	Normal
	Duração
	40 s
	60 s
	Dor
	Sim
	Não
	Contratura
	Sim
	Não
	Lactato
	não
	Sim
Isquemia contração
CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO.
1) Em 1780, Lavoisier e Laplace estudavam os mecanismos de respiração num mixto de calorímetro e respirômetro contruído por êles próprios e publicavam:
 
	
	
Produção de CO2
	
Gelo derretido
	
Gelo/CO2
	
Carvão
	
112.35 g
	
2998 g
	
26.69
	
Cobaia
	
11.87 g
	
330.3 g
	
27.80
				
Analise a tabela. Qual conclusão você pode tirar dos dados?
Nos seus trabalhos,Lavoisier comparava a respiração de um animal com a queima de uma vela. Êle tinha notado que em ambos os processos havia consumo de oxigênio e produção de CO2. Lavoisier concluia seus estudos sobre respiração em seres vivos com a seguinte frase
'" Respiração é, por conseguinte, uma combustão, muito lenta é verdade, mas de outra maneira perfeitamente igual àquela do carvão; ela ocorre no interior dos pulmões, sem produzir luz perceptível, porque a chama é imediatamente absorvida pela umidade dos órgãos"
Quanto ao material que supostamente sofria combustão durante a respiração, Lavoisier propõe que é "um humor... principalmente composto de hidrogênio e carbono, carregado pelo sangue e derivado da comida".
2) Lavoisier morreu na guilhotina. Como profetizado por La Grange "Mais de cem anos poderão se passar antes que apareça outra cabeça como essa ". Entre 1935-1936, Szent-Györgyi começou a publicar uma série de estudos sobre respiração usando suspensão de músculo peitoral de pombo. Sendo um músculo utilizado para voar, e portanto extremamente requerente de energia, a capacidade oxidativa deste tecido é extraordinàriamente alta, o que tornava seus produtos de oxidação mensuráveis. Esses pesquisadores demonstraram que:
a) Quantidades minúsculas de ácidos dicarboxílicos ( succínico, fumárico, málico e oxalacetato) são capazes de aumentar a respiração, e esse aumento é um múltiplo da quantidade de oxigênio necessária para a oxidação dessas substâncias.
b) Os ácidos dicarboxílicos não são consumidos, podendo ser subsequentemente detectados no meio.
c) Compostos de 3 carbonos (intermediários da via glicolítica) eram capazes de transferir seus hidrogênios (na presença de oxigênio) para o oxalacetato.
d) Malonato, que inibe oxidação de succinato nos tecidos é um poderoso inibidor da respiração celular.
Estava feita uma ligação entre o que acontece na "queima" de glicose (comida) e a respiração celular.
Explique cada um dos resultados obtidos em cada um dos items.
Analise esses dados e proponha uma rota de utilização de glicose na presença de oxigênio. Szent-Györgyi já tinha conhecimento de enzimas chamadas "desidrogenases"que levavam hidrogênios até o oxigênio.
 
 Estrutura dos compostos envolvidos
3) Em 1937, Krebs e Johnson publicaram que ácido cítrico é um ativador catalítico da oxidação de carbohidratos em músculo. Como você provaria que o ácido cítrico participa ou não da mesma rota mtabólica dos outros ácidos dicarbixílicos?
4) Em março de 1937, Martius e Knoop descobriram o caminho biológico para oxidação de citrato. 
Só foi possível demonstrar essa reação utilizando um inibidor específico da oxidação de ácidos cetônicos, o óxido de arsênio, que levava ao acúmulo de (-cetoglutarato.
O que você acha que Krebs fez quando leu os trabalhos de Martius e Knoop? 
5) Desenhe agora o ciclo do ácido cítrico com todos os intermediários que você propõe. A ligação entre a glicólise e o ciclo de Krebs não foi esclarecida nessa época. Apenas 10 anos mais tarde, Lynen descreveu a conversão de piruvato a acetil CoA que então se condensaria com oxalacetato para formar citrato.
6) Em seus trabalhos, em 1936, Szent-Györgyi propos que "triose" (intermediário de 3 carbonos da via glicolítica) formaria oxalacetato durante a sua "queima" na presença de oxigênio. Estava Szent-Györgyi errado?
7) No decorrer da história da humanidade, os grandes avanços no entendimento do Universo e no tratamento de doenças se basearam no desenvolvimento da ciência. A célebre frase "Não existe ciência aplicada; existem aplicações da ciência",foi dita por Pasteur no século XIX. Já em 1937, em decorrência de seus trabalhos, Korányi e Szent-Györgyi anunciavam que diminuiam o grau de acidose metabólica em pacientes diabéticos alimentando-os com ácido succínico. Embora esse tratamento não tenha se mostrado suficiente para a cura da diabete, até hoje trata-se crise glicêmica com uma mistura que inclue citrato em sua composição. Krebs, em 1937, sugeria esse medicamento alternativo por ser "mais agradável ao paladar e mais barato". Você pode propor uma base metabólica para esses tratamentos? O que faltaria ao diabético?
8) Porque "in vivo" o nivel de intermediários do ciclo de Krebs não permanece constante durante as diferentes situações metabólicas? Qual o destino dos hidrogênios liberados no ciclo do ácido cítrico? Discuta o papel central do ciclo do ácido cítrico no metabolismo intermediário.
9) O ciclo de Krebs passa-se na matriz mitocondrial. Em que condições haveria citrato no citoplasma celular? Quais as consequências metabólicas desse fato.
� EMBED PaintShopPro ���
UFRJ
Glicogênio
Glicose + ativador
Glicose
Nenhuma adição
� EMBED SPW 8.0 Graph ���
� EMBED SPW 8.0 Graph ���
� EMBED JSSPWGraphic ���
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_79017940/ole-[FB, 66, 00, 00, 88, 88, 00, 0C]
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Chart6
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		1,6		0,8		0,38		0,009
		1,68		1		0,55		0,01
Tempo (min)
Lactato (mg)
Sheet1
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Tempo (min)
Lactato (mg)
Sheet2
		
Sheet3
		
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