Bioquimica I - Módulo I

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Vivian Rocha 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Bioquímica I 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2011/1
 
 
Sumário 
Módulo I ................................................................................................................................... 4 
Aula 1 - Estrutura e Função dos Aminoácidos ..................................................................... 4 
Proteínas ............................................................................................................................ 5 
Aminoácidos ..................................................................................................................... 7 
Propriedades Gerais dos Aminoácidos ........................................................................... 10 
Aula 2 - Propriedades Físico-químicas dos Aminoácidos .................................................. 13 
Constante de Dissociação de um Ácido Fraco ................................................................ 13 
Constante de Equilíbrio .................................................................................................. 14 
Titulação do Ácido Acético – Um Ácido Orgânico Fraco ............................................. 16 
Formas Iônicas e Ponto Isoelétrico ................................................................................. 18 
Aula 3 - Técnicas de Fracionamento de Aminoácidos ....................................................... 21 
Metodologias de separação ............................................................................................. 21 
Técnicas de Fracionamento ............................................................................................ 22 
Aula 4 - Estrutura de Proteínas ........................................................................................... 37 
A Formação da Cadeia Polipeptídica .............................................................................. 38 
As Ligações Peptídicas Ocorrem em Trans ou em Cis ................................................... 39 
Geometria da Ligação Peptídica ..................................................................................... 39 
A Ligação Peptídica Apresenta Característica de Dupla Ligação .................................. 40 
Torções são possíveis ao redor da ligação Phi (φ) e Psi (ψ) ........................................... 40 
Plot Ramachandran ......................................................................................................... 41 
Alfa Hélice ...................................................................................................................... 42 
Fita Beta .......................................................................................................................... 43 
Aula 5 - Métodos para Purificação de Proteínas ................................................................ 48 
Salting in x Salting out .................................................................................................... 49 
Técnicas de fracionamento em proteínas ........................................................................ 50 
Cromatografias Líquidas ................................................................................................. 50 
Eletroforese ..................................................................................................................... 53 
Isoletrofocalização .......................................................................................................... 55 
Eletroforese Bidimensional ............................................................................................. 56 
Aula 6 - Sequenciamento de Proteínas ............................................................................... 58 
Preparo da Proteína para o Sequenciamento ................................................................... 59 
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I. Redução das Pontes Dissulfeto .................................................................................... 60 
II. Composição de Aminoácidos da Proteína .................................................................. 60 
III. Determinação do Resíduo N-terminal ...................................................................... 61 
IV. Determinação do Resíduo C-terminal ...................................................................... 62 
V. Sequenciamento da Cadeia Polipeptídica .................................................................. 62 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Vivian Rocha 
 
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Módulo I 
AULA 1 - ESTRUTURA E FUNÇÃO DOS AMINOÁCIDOS 
Na terra existe uma grande diversidade de seres vivos, que são constituídos por células. 
Dependendo da complexidade estrutural dessas células elas podem ser classificadas como 
procariontes, células com uma constituição celular mais simples, delimitadas por uma única unidade 
de membrana que separa o meio intracelular do meio extracelular, dentro desse único 
compartimento são realizados todos os processos fisiológicos responsáveis pela vida dela. Por outro 
lado existem células com uma organização estrutural mais complexa que são as células eucariontes 
que além da unidade de membrana que delimita a célula do meio ambiente também possui uma 
serie de compartimentos delimitados por uma ou duas unidades de membrana que vão conter 
conjuntos específicos de proteínas, fazendo com que estes compartimentos exerçam uma função 
específica dentro da célula. 
Independente da complexidade estrutural dessas células, ela possui um objetivo final e para 
conseguir esse objetivo a célula deve ser capaz de realizar um serie de funções, dentre as quais 
podemos citar a capacidade de extrair do meio ambiente matéria e energia, e dependendo do tipo 
celular o requerimento de matéria e energia são bem diferentes. 
Por exemplo, os organismos autotróficos possuem um requerimento relativamente simples 
em termos do tipo de matéria e energia do qual precisam para viver, sendo assim para esses 
organismos geralmente a matéria pode ser oferecida de forma relativamente simples como sais 
inorgânicos, sais de nitrogênio atmosférico, gás carbônico e água. A partir desses componentes 
inorgânicos e utilizando a radiação eletromagnética proveniente do sol esses organismos conseguem 
transformar essa matéria e energia em todas as moléculas orgânicas que constituem a estrutura 
celular. 
Por outro lado outros tipos de célula que são classificados como organismos heterotróficos 
possuem um requerimento mais elaborado em relação ao tipo de matéria e energia que eles 
necessitam, esses organismos geralmente requerem que a matéria seja oferecida sobre a forma de 
matéria orgânica mais complexa como açúcares, proteínas, lipídios e assim por diante e a energia 
geralmente é retirada da oxidação dessas moléculas orgânicas complexas. 
Com isso além de necessitar do ambiente matéria e energia essas células devem ser capazes 
de transformar essa matéria e energia em novos constituintes celulares. 
Esses organismos que são compostos por células devem ser capazes de utilizar as 
características químicas dos compostos que compõem sua estrutura para realizar tarefas. 
Se analisarmos a constituição química de vários tipos celulares diferentes, vamos encontrar 
vários compostos que são diferem entre uma célula e outra, entretanto também é possível observar 
que existe um grupo de compostos com características estruturais bastante semelhantes que são 
encontrados em grande abundância em qualquer tipo de célula. 
Analisando essa composição
da célula, verificamos que ela é composta por quatro tipos 
principais de biomoléculas: 
 Polissacarídeos; 
 Lipídeos; 
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 Ácidos Nucleicos (DNA e RNA); 
 Proteínas. 
Que são encontrados indistintamente em qualquer tipo celular. 
Os polissacarídeos possuem tanto a função de reserva energética como estrutural. Alguns 
exemplos de polissacarídeos que funcionam como reserva de energia são o amido e glicogênio. Ou 
podem formar estruturas que revestem a célula formando a parede celular ou glicocálix de células 
microbianas. 
Os lipídios também apresentam características tanto de reserva de energia quanto estrutural, 
além disso, são os principais constituintes da bicamada lipídica que formam as unidades de 
membrana presentes em todos os tipos de celulares. Essa bicamada lipídica participa do processo de 
permeabilidade seletiva que permite manter a integridade e a condição da célula em relação ao meio 
ambiente. 
Ha também ácidos nucléicos do tipo DNA e RNA que armazenam a informação genética 
necessária principalmente para codificação de proteínas necessárias para a fisiologia do organismo. 
O RNA geralmente é a forma como aquela informação é acessível à célula. 
 Por fim há um quarto grupo bastante importante de moléculas biológicas que são as 
proteínas, que realizam 99,99% das tarefas que as células necessitam para sobreviver. 
Abaixo segue uma lista da serie de funções realizadas por essas proteínas. 
 Funcionam como catalisadores biológicos; 
 Realizam a seleção de compostos que entram e saem da célula; 
 Produzem movimento; 
 Transportam vesículas e partículas dentro da célula; 
 Funcionam como sinalizadores (hormônios); 
 Participam dos mecanismos de defesa celular. 
Proteínas 
Existe uma classe muito importante de proteínas que são as enzimas que possuem a função 
de acelerar a velocidade de uma determinada reação química necessária à vida da célula. De tal 
forma que uma reação na ausência de um catalisador seja processada em uma velocidade tão baixa 
que é incompatível com a vida da célula, já na presença desses catalisadores a reação é acelerada 
em diversas vezes, com isso a velocidade de formação dos compostos passa a ser compatível com 
as necessidades daquela célula. 
Um exemplo da utilização desses catalisadores é a conversão da glicose em ácido pirúvico 
através da via glicolítica para produção de energia sobre a forma de ATP e NADH. Para realizar 
essa conversão há a necessidade da ação conjunta de pelo menos 10 proteínas diferentes, que 
gradualmente modificam a estrutura da glicose. Nesse processo parte da energia da glicose é 
transferida para as moléculas de ATP e de NADH. 
Da mesma forma que temos essa reação existem milhares de reações químicas que são 
necessárias na célula e que são catalisadas por tipos especiais de proteínas. Proteínas estas que 
também participam do processo de permeabilidade seletiva da membrana, regulando os compostos 
que entram e saem da célula. 
Com isso a permeabilidade seletiva da membrana biológica e dada por dois componentes, à 
bicamada lipídica que bloqueia a livre difusão através da membrana de compostos com 
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características polares e que não se dissolvem bem no interior hidrofílico da membrana biológica. 
Entre tanto, muitos dos compostos que devem trafegar através dessa membrana são compostos com 
características polares, sendo assim um conjunto de proteínas que funcionam como transportadores 
ou como canais que auxiliam na passagem dessas substâncias polares de um lado para outro dentro. 
Essas proteínas também participam processos que produzem movimento como, por 
exemplo, a contração muscular, que envolve a ação conjunta de pelo menos dois tipos principais de 
proteínas que são os microfilamentos de actina, uma estrutura proteica associada a uma proteína 
motora que é a miosina. Essa proteína motora em associação com o filamento produz a contração de 
milhares de células que em conjunto produzem um movimento macroscópico que é a contração 
muscular. 
Proteínas também podem funcionar como sinalizadores entre tipos celulares distintos 
principalmente em organismos multicelulares. Um exemplo, de sinalizador proteico é a insulina que 
regula os níveis de glicose no sangue. 
A participação das proteínas nos mecanismos de defesa da célula. Todas as imunoglobulinas 
IGA, IGM, IGG e assim por diante possuem natureza proteica, bem como as proteínas sintetizadas 
pelas células de defesa que vão atacar os organismos invasores. 
Funcionalidade das Proteínas 
A proteína exerce uma função específica, sendo assim para cada tipo de atividade que uma 
célula deve realizar ela vai contar com a ação de uma proteína ou um conjunto de proteínas que 
trabalhando coordenadamente vão dar cabo daquela função. A função dessa proteína é determinada 
em ultima analise por sua sequência de aminoácidos que é chamada de estrutura primária, que 
indica como aquela determinada proteína vai se organizar espacialmente sendo responsável pela 
estrutura tridimensional dela. 
“A funcionalidade das proteínas é derivada de sua estrutura primária” 
Vamos citar como exemplo 4 tipos de proteínas diferentes com formas diferentes e 
exercendo funções distintas dentro da célula. 
A primeira é uma enzima Fenilalanina Hidroxilase cujo gen é mutado em uma doença 
hereditária que é detectada no Brasil pelo teste do pezinho que sinaliza a presença de níveis 
elevados de Fenilalanina no sangue. A Fenilalanina hidroxilase é uma proteína constituída por um 
único tipo de cadeia polipeptídica, associada a três outras subunidades exatamente iguais formando 
uma estrutura quaternária contendo quatro subunidades idênticas. 
O Microfilamento de Actina pode atingir comprimentos de variados e em teoria poderia 
atravessar de um lado a outro da célula. Essa proteína é composta por uma subunidade menor que é 
formada por dois monômeros de actina, sendo uma unidade funcional dimérica que pode se associar 
a outros dímeros formando o filamento que participa da formação do citoesqueleto da célula. 
A imunoglobulina G é um anticorpo que possui dois domínios funcionais. 
O último tipo de proteína é um hormônio de crescimento. Este é liberado na corrente 
sanguínea por uma determinada glândula e se difunde pelo organismo ate atingir a superfície da 
célula alvo. Essa célula alvo expressa outra proteína que é uma proteína integral de membrana onde 
a parte voltada para o lado de fora da célula tem um sítio de ligação especifico para esse hormônio 
que ao se ligar altera a conformação desta proteína, essa alteração de conformação é transferida ao 
longo da proteína para face intracelular e isso dispara um sinal para promover o inicio da 
proliferação da célula. 
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Chamamos a atenção para uma coisa, para cada tipo de função você precisa de uma estrutura 
proteica diferente e essa estrutura proteica distinta é que vai produzir uma determinada função 
biológica, ou seja, “a funcionalidade das proteínas é derivada de sua estrutura primária”. 
Essa estrutura vai estar diretamente ligada à sequência de aminoácidos dessa proteína que 
por sua vez é mantida de forma mais fiel através do genoma. Então a função básica do genoma seria 
codificar proteínas para que estas possam atender as funções que a células necessitam para 
sobreviver. Uma função adicional é que além de codificar a proteína e codificar informações que 
dizem em que momento aquele informação deve ser expressa e com que intensidade ela é expressa. 
Aminoácidos 
As proteínas são polímeros de aminoácidos. Existem 22 tipos de aminoácidos que são 
incorporados à estrutura primária das proteínas durante o processo de biossíntese proteica que
é 
catalisado pelos ribossomos. O que vai diferir uma proteína da outra é 
 O número de aminoácidos presentes naquela cadeia; 
 À composição de aminoácidos daquela cadeia peptídica; 
 E principalmente a ordem com que aqueles aminoácidos estão dispostos ao longo da 
proteína. 
Esses aminoácidos são moléculas com uma estrutura bastante característica, que se 
caracteriza por apresentar um carbono que é chamado de carbono alfa ao qual estão ligados 
componentes que são invariavelmente encontrados em todas as moléculas de aminoácidos. 
Os aminoácidos possuem ligados ao carbono α: 
 Um grupamento carboxílico 
 Um grupamento amino 
 Um hidrogênio 
 Um radical R 
 
 
O radical R é uma parte variável localizado na cadeia lateral, cuja estrutura vai distinguir um 
aminoácido do outro. 
Destes 22 tipos de aminoácidos que são incorporados à estrutura da proteína, 21 apresentam 
uma característica particular, onde o radical R é distinto dos outros três grupamentos encontrados. 
Exceto na Glicina cuja radical R também é um hidrogênio, com isso a grande maioria dos 
aminoácidos apresenta o carbono alfa com quatro substituintes diferentes, sendo um carbono 
quiral e por tanto tem isomeria ótica. 
“Quando um átomo de carbono apresenta quatro substituintes diferentes ele apresenta assimetria.” 
 Moléculas com carbonos assimétricos, como os aminoácidos, podem existir sob formas 
isoméricas de maneira geral chamadas de estereoisômeros que apresentam diferentes 
configurações espaciais. 
 Uma classe especial de estereoisômeros é chamada de enantiômero, se caracterizam por 
forma imagens especulares não superponíveis uma as outras. 
 Os dois enantiômeros de um composto possuem propriedades químicas idênticas: o 
mesmo ponto de fusão, mesmo ponto de ebulição e assim por diante, entre tanto diferem 
na habilidade de desviar o plano da luz polarizada. 
Figura 1 - Estrutura Geral de 
um Aminoácido 
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 Essas moléculas com carbono assimétrico são chamados de compostos quirais e o átomo 
assimétrico é denominado átomo quiral ou centro quiral. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Na esquerda uma molécula quiral com centro de assimetria, ou seja, com quatro 
substituintes diferentes e do lado direito uma molécula aquiral onde dois dos substituintes são iguais 
entre si. 
Para determinar se uma molécula é quiral ou não, geramos uma imagem especular da 
molécula, ou seja, a imagem refletida no espelho. 
Para cada centro de assimetria podemos ter duas formas isoméricas da molécula, com isso se 
a molécula possui um único centro de assimetria ela pode existir sob a forma desses dois isômeros, 
que tem as mesmas características químicas mais que podem ser distinguidos pela forma como eles 
deviam o plano da luz polarizada. Sendo assim cada um desses isômeros podem ser distinguidos 
pelos sistemas biológicos. 
Esses centros quirais podem forma tipos especiais de isômeros que são enantiômeros que se 
caracterizam por formar imagens especulares não superponíveis umas das outras. Essas moléculas 
com esse centros de assimetrias podem ser diferenciadas de três formas distintas: 
As moléculas com centros assimétricos podem ser classificadas em: 
 Dextrorotatória ou levorotatória (d ou l) – de acordo se elas desviam o plano da luz 
polarizada para direita ou para esquerda. 
 Ou pela convenção de Fischer, baseado na configuração relativa do gliceraldeído (D 
ou L). 
 Ou pelo sistema Cahn-Ingold-Prelog (R ou S). 
Dextrorotatória ou Levorotatória 
A primeira forma de diferenciar cada um dos componentes do par de enantiômeros e uma 
forma empírica, ou seja, uma forma prática. Onde separamos cada um dos componentes do 
enantiômero e coloca em um equipamento para observar como aquele enantiômero desvia o plano 
da luz polarizada. Com isso podemos empiricamente classificar esses dois compostos de um par de 
enantiômeros através da capacidade de cada um deles girar o plano da luz polarizada para direita ou 
para esquerda. Se ele girar o plano da luz para direita ele é chamado de dextrorotatório e o 
composto recebe a designação d escrito em letra minúscula e em itálico, se ele desviar o plano da 
luz polarizada para esquerda o enantiômero é chamado de levorotaóorio e a frente do composto ele 
recebe a letra l minúscula e em itálico. 
Esta é a forma de classificar empiricamente cada um dos compostos do par de enantiômeros. 
Mais essa classificação empírica nada diz a respeito da estrutura da molécula. Sabe-se apenas para 
Figura 2 - Molécula quiral Figura 3 - Molécula aquiral 
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onde o plano da luz gira, não te da idéia nenhuma de como seria a configuração espacial daquela 
molécula. 
Convenção de Fischer 
Para tentar resolver isso um pesquisador alemão Fischer começou a estudar esses compostos 
isoméricos em carboidratos e utilizou um açúcar bastante simples de três carbonos apenas para 
montar um sistema arbitrário para designar a estrutura para esses isômeros. Ele arbitrou uma 
configuração espacial para cada um dos compostos do enantiômero desse açúcar o glicerolaldeído. 
Colocando grupamento aldeído e o grupamento metoxila acima e a baixo do plano da molécula 
respectivamente e orientou a hidroxila alcoólica para direita ou para esquerda que são as duas 
configurações possíveis do glicerolaldeído. Com isso designou uma estrutura de D-glicerolaldeído e 
a outra estrutura de L-glicerolaldeído simplesmente pela posição da hidroxila alcoólica. 
No D-glicerolaldeído a hidroxila esta voltada para direita e no L-glicerolaldeído para 
esquerda. Essa configuração arbitrária nada tinha haver com a capacidade de como o D-
glicerolaldeído gira o plano da luz para a direita ou do L-glicerolaldeído girar plano da luz para 
esquerda. Pois não havia naquela época como correlacionar a forma geométrica absoluta com a 
capacidade da molécula de girar o plano da luz para direita ou esquerda. 
Nem todas as moléculas que desviam o plano da luz polarizada para a direita têm a 
configuração D, mas no caso especifico do glicerolaldeído isso é verdade. 
Cahn-Ingold-Prelog 
E uma terceira forma de se classificar esse par de enantiômero e através do sistema de Cahn-
Ingold-Prelog que foi adotado pela IUPAC. Nesta nomenclatura ha uma forma diferente de nomear 
os centros assimétricos, onde são atribuídas ordens de prioridades aqueles agrupamentos, os 
agrupamentos de maior massa recebem maior prioridade e os grupamentos de menor massa 
recebem menor prioridade. O elemento de menor prioridade, ou de menor massa molecular é jogado 
para trás do plano da molécula, os três grupamentos principais ficam voltados para frente e a forma 
como você alinha os números 1, 2 e 3 eles vão designar se temos uma configuração S ou R. No 
primeiro caso o 1, 2 e 3 girando no sentido anti-horário a configuração seria S, se a configuração 
da molécula tivesse 1, 2 e 3 alinhado no sentido horário a configuração seria R. 
 
Figura 4 - A L-Serina apresenta configuração S. 
Com isso a determinação da configuração da estrutura do aminoácido difere ligeiramente no 
sistema de nomenclatura RS. 
A cada grupamento ligado a um carbono quiral é atribuída uma prioridade com base na 
massa atômica, 4 sendo a mais baixa prioridade; 
A molécula é orientada com o grupamento de menor prioridade voltado para trás (oculto 
pelo carbono quiral), e um caminho é traçado a partir do grupamento de maior prioridade para o 
grupamento de menor prioridade; 
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A configuração do centro quiral é estabelecida: se a sequência 1, 2, 3 é lida no sentido 
horário, a configuração é R. Se a sequência 1, 2, 3 é lida no sentido anti-horário, a configuração é S. 
Como nem todos os aminoácidos
possuem a mesma designação RS (L-Cisteína tem a 
configuração R), p sistema DL é mais comumente usado na bioquímica. 
 
Esse sistema de classificação dos centros assimétricos é o melhor que existe, por que através 
desse sistema podemos classificar qualquer centro de assimetria existente na molécula. Enquanto no 
sistema de configuração relativa de Fischer só podemos assinalar a configuração de um centro. 
Entre tanto como toda bioquímica básica foi elaborada na separação dos centros 
assimétricos pela configuração de Fischer. A nomenclatura d e l adotada no sistema de Fischer é 
diferente da D e L que é assinalada para o desvio da luz polarizada, então na medida do desvio da 
luz polarizada, temos assinalado d e l minúsculo e em itálico. Na conversão de Fischer temos na 
designação dos compostos feitas com base em D e L maiúsculo. 
Apesar de cada molécula existir em duas conformações distintas, geralmente os organismos 
preferem utilizar apenas uma forma enantiomérica da molécula à , no forma L dos aminoácidos
caso dos açúcares é a . forma D
Os seres vivos conseguem distinguir uma forma enantiomérica da outra através da forma 
como aquelas moléculas interagem com as proteínas. Quando a molécula do carbono quiral interage 
com a proteína um centro especial chamado sítio de ligação, para que esta interação ocorra de forma 
perfeita precisa haver uma interação perfeita de três pontos entre a proteína e a molécula com a qual 
ela quer interagir, com isso através dessa ligação específica conseguimos distinguir um par de 
enantiômero do outro, pois a célula só vai usar um par que ela consegue reconhecer. 
Um exemplo clássico dessa capacidade de distinção dos enantiômero pelos organismos seria 
um enantiômero produzido por plantas, onde uma forma enantiomérica que é a S tem odor de 
cominho, enquanto que o isômero R tem cheiro de menta. São respostas completamente diferentes 
que o organismo da a um par de enantiômeros da molécula e essa resposta em ultima analise e 
diferente porque essa molécula se liga a um receptor proteico no bulbo olfativo distinto dando uma 
resposta diferente. 
Propriedades Gerais dos Aminoácidos 
Os aminoácidos diferem uns dos outros nos grupamentos laterais (radical R) ligados ao 
carbono  
Os grupamentos R dos aminoácidos podem ser classificados em relação à capacidade deles 
se dissolverem bem ou não em um ambiente aquoso e nesse sentido classificamos primeiro os 
aminoácidos não polares que possuem características hidrofóbicas e polares que possuem 
características hidrofílicas. Esses aminoácidos polares com características hidrofílicas são 
sequencialmente subdivididos em polares não carregados e polares carregados e por sua vez esse 
aminoácidos polares carregados são subdivididos em polares carregados com características ácidas 
e polares carregados com característica básicas. 
 Não Polares; 
 Polares não carregados; 
 Polares carregados; 
 Polares carregados com características ácidas; 
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 Polares carregados com característica básicas. 
Na tabela abaixo temos essa classificação onde os aminoácidos estão representados e 
agrupados em regiões coloridas. A estrutura da cadeia lateral esta representada em azul. 
A área laranja da tabela são os aminoácidos 
com características hidrofóbicas, ou seja, que não se 
dissolvem bem em água. Quase todas as cadeias com 
características hidrofóbicas são formadas quase que 
exclusivamente por carbono e hidrogênio, ou seja, 
hidrocarbonetos que não se dissolvem bem em água, 
por outro lado todos os outros aminoácidos 
localizados na região ver limão, púrpura e azul claro 
são aminoácidos com características hidrofílicas, ou 
seja, são aminoácidos polares e o que caracteriza a 
maioria desses aminoácidos é presença de pelo 
menos um átomo eletronegativo nessa cadeia como, 
por exemplo, o oxigênio, nitrogênio, enxofre e assim 
por diante. Esses átomos eletronegativos ao 
participarem da ligação química puxam a nuvem de 
elétrons para próximo deles criando um dipolo na cadeia lateral, ou seja, parte da cadeia lateral 
possui uma carga parcial negativa e outra parte da cadeia tem uma carga parcial positiva e essas 
cargas parciais positivas e negativas tendem a forma pontes de hidrogênio com a água, nesse 
sentido essas cadeias laterais interagem bem com ambiente aquoso do interior da célula. Os polares 
não carregados estão na região verde onde no pH fisiológico existente dentro da célula as cadeias 
laterais não se dissociam e, portanto não tem carga. Na região púrpura e na região azul esses 
aminoácidos possuem grupamentos na cadeia lateral que no pH fisiológico da célula por volta de 7 
às cadeias laterais estão prótonadas ou desprótonadas, portanto vão ter carga negativa ou positiva. 
Por sua vez esses aminoácidos polares carregados são subdivididos em aminoácidos com 
características ácidas que é ácido glutâmico e o Ácido Aspártico que tem grupamento carboxílico na 
cadeia lateral e em pH 7 essa carboxila esta desprótonada e tem carga negativa. Polares carregados 
com características básicas que são a Lisina, Arginina e a Histidina que possuem cadeias laterais 
com amina primária ou amina secundária ou amina terciária que em pH 7 elas estão carregadas 
positivamente. 
Valina, Leucina e Isoleucina possuem uma característica interessante na cadeia lateral, todos 
eles são ramificados, são muitos conhecidos, pois existem suplementos alimentares que contem 
esses aminoácidos. 
A Prolina é o único aminoácido que possui a cadeia lateral fechada, essa característica da 
Prolina faz com que ela tenha um papel importante na aquisição da estrutura secundária e terciária 
das proteínas. 
Durante o processo de biossíntese proteica ha a incorporação de 20 tipos de aminoácidos 
diferentes na estrutura primária das proteínas. Dez anos atrás foi descoberta a existência da 
Selenocisteína e 5 anos atrás a Pirrolisina. Analisando a estrutura de proteínas celulares além dos 22 
tipos de aminoácidos são encontrados pelo menos 40 aminoácidos diferentes nas proteínas que não 
são incorporados nos ribossomos, na realidade eles são modificações daqueles 22 tipos de 
aminoácidos dos quais são constituídas as proteínas no processo de biossíntese. 
Figura 5 - Classificação dos aminoácidos quanto 
à polaridade 
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Alguns aminoácidos que são comumente encontrados nas proteínas e que são formados após 
á biossíntese proteica, dois exemplos bastante conhecidos são a 4-Hidroxiprolina e a 5-Hidroxilisina 
que vão estar presentes principalmente na estrutura do colágeno. 
Os aminoácidos além de servirem para a biossíntese de proteínas são precursores de várias 
moléculas com atividade biológica importante. O Triptofano pode ser modificado para forma 
serotonina que é um neurotransmissor ou pode ser convertido em melatonina que controla o ciclo 
circadiano (de atividade e inatividade que os animais possuem). Outro exemplo é a Tirosina, onde a 
partir dela é possível produzir dopamina que é um neurotransmissor, essa dopamina pode ser 
hidroxilada formando noroepinefrina que também é conhecida como noradrenalina que é um 
hormônio que regula o metabolismo energético na célula e a noroepinefrina também pode ser metila 
formando epinefrina que é outro hormônio que regula metabolismo energético na célula. 
No quadro abaixo ha uma divisão dos aminoácidos, no caso só os 20 aminoácidos clássicos, 
pelo fato da Selenocisteína e da Pirrolisina serem descobertas recentes. Esses vinte aminoácidos são 
classificados em essenciais e não essenciais. Este termo essencial ou não essencial é um termo 
ligado à nutrição, de uma maneira geral componentes essenciais são aqueles nutrientes que o 
organismo não consegue
produzir e por tanto obrigatoriamente estes devem ser obtidos na dieta. 
 
Tabela 1 - Classificação da essencialidade dos aminoácidos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Essencial Não Essencial
Isoleucina Alanina
Leucina Arginina*
Lisina Aspartato
Metionina Cisteína*
Phenilalanina Glutamato
Treonina Gutamina*
Triptofano Clicina*
Valina Prolina*
Histidina Serina*
Tirosina* Asparagina*
Selenocisteína** Pirrolisina**
(*) Essencial sob certas circunstancias 
(**) Não classificado
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AULA 2 - PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DOS 
AMINOÁCIDOS 
Os aminoácidos possuem uma estrutura básica que apresenta uma parte comum a todos eles. 
Em relação a esta parte invariável há um grupamento α-carboxílico e um grupamento amino que 
possuem propriedades ácidas, ou seja, tanto o grupamento carboxílico como o grupamento amino 
são ácidos orgânicos. Existem alguns aminoácidos onde na cadeia lateral também são encontrados 
ácidos orgânicos, então veremos algumas propriedades desses ácidos orgânicos que são ácidos 
fracos. 
Constante de Dissociação de um Ácido Fraco 
Quando um ácido orgânico e dissolvido em água, este se dissocia parcialmente, esta ocorre 
ate que haja um equilibro entre o ácido original e a base deriva daquele ácido. 
 Quando um ácido orgânico, como o ácido láctico, é dissolvido em água este se dissocia Ex.:
parcialmente, estabelecendo um equilíbrio entre a forma ácida (doador de próton) e o ânion do 
ácido e o próton. 
 
 
O ácido láctico é e a sua base formada por sua dissociação são denominados de par 
 conjugado.
A tendência de um ácido fraco dissociar H
+
 pode ser avaliada a partir de sua constante de 
equilíbrio (Keq). E nesse sentido quanto menor a constante de equilibro, menor será capacidade de 
se dissociar e consequentemente mais fraco é o ácido. 
Uma forma conveniente de definir a Keq é sob a forma de pK: 
 
 
No caso do ácido láctico que exemplificamos acima, este é dissolvido em água e 
imediatamente começa a se dissociar formando lactato mais prótons (H
+
) ate que haja um equilíbrio 
entre a sua forma ácida e sua base conjugada. 
A reação de dissociação de um ácido pode ser escrita da seguinte forma: 
O próton associado com a base conjugada forma um ácido conjugado (HA), sendo este 
reversivelmente dissociável formando a base conjugada (A
-
) mais prótons (H
+
) (como mostrado abaixo). 
 
 
Tendo as concentrações de substratos e reagentes também é possível calcular a constante de 
equilíbrio, que é dada simplesmente pela divisão entre a concentração dos produtos da reação que 
seriam a base conjugada e os prótons pela concentração do ácido conjugado (como mostrado abaixo). 
 
 
 
 
 
Á𝒄𝒊𝒅𝒐 𝒍á𝒕𝒊𝒄𝒐 ⇌ 𝒍𝒂𝒄𝒕𝒂𝒕𝒐 +𝑯+ 
 
𝒑𝑲 = 𝒍𝒐𝒈 𝟏/𝑲𝒆𝒒 
 
𝑯𝑨 ⇌ 𝑨− + 𝑯+ 
 
𝑲𝒆𝒒 =
[𝑨−]. [𝑯+]
[𝑯𝑨]
 
 
Vivian Rocha 
 
14 
 
Constante de Equilíbrio 
A força de um ácido é medida pela sua Constante de Equilíbrio. Os ácidos orgânicos fracos 
quando colocados em solução aquosa se dissociam parcialmente e no equilíbrio em uma proporção 
fixa entre o ácido conjugado e a base deriva deste ácido. Esses ácidos são classificados em fortes ou 
fracos de acordo com a constante de equilíbrio. 
Por outro lado os são aqueles cuja constante de equilíbrio é um número ácidos fortes maior 
 o que indica que a razão entre a quantidade de base conjugado e ácido conjugado tende do que 1
mais para o lado da base, ou seja, existe e muito mais base conjugada do que ácido
consequentemente a tendência daquele ácido se dissociar quando em solução aquosa é . alta
 
 
 
 
Os são aqueles que possuem a constante de equilíbrio o que ácidos fracos menor do que 1
indica que a razão entre a quantidade de base conjugada e ácido conjugado tende mais para o lado 
do ácido, ou seja, existe e consequentemente a muito mais ácido conjugado do que base
tendência daquele ácido se dissociar quando em solução aquosa é . baixa
 
 
 
 
As constantes de dissociação desses ácidos fracos são números muito pequenos e uma forma 
adequada de expressar esses números pequenos é através do seu pK que é expresso como logaritmo 
na base 10 do inverso da constante de equilíbrio (Keq). 
 
 
Este artifício transforma esse números com varias casas decimais em números geralmente 
pequenos entre 0 e 13 facilitando o cálculo. 
A tabela ao lado apresenta uma serie de ácidos 
com suas constantes de equilíbrio. Todos eles são 
fracos, porque a constante de equilíbrio de todos eles 
é menor do que 1. Pelas constantes de equilíbrio 
desses ácidos fracos é possível observar que apesar de 
todos eles serem ácidos fracos uns são mais fracos do 
que outros. Essas constantes de equilíbrio de ácidos 
fracos geralmente geram números muito pequenos. 
 Por esse motivo foi elaborada uma forma de 
transformar esses números muito pequenos em 
números que pudessem ser utilizados de forma 
decente, para isso foi introduzido o conceito de pK 
que possui uma lógica semelhante ao pH. 
Como as concentrações de hidrogênio da água são em números muito pequenos, existe o 
conceito de pH. No caso da constante de equilíbrio como são números muito pequenos foi 
Tabela 2 - Ácidos e suas Constantes de Equilíbrio . 
𝒑𝑲 = 𝒍𝒐𝒈 𝟏/𝑲𝒆𝒒 
 
Vivian Rocha 
 
15 
 
introduzido o conceito de pK e da mesma forma que o pH o pK é o log na base 10 do inverso da 
constante de equilíbrio (fórmula na pág. 14). 
Lei Le Chatelier 
Existe uma equação que consegue correlacionar a razão entre a concentração da base e do 
ácido conjugado em função do pH do meio que é Principio de Le Chatelier: 
 
 
 
A relação entre base e ácido conjugado no caso de um ácido 
fraco ele será diretamente dependente da concentração de prótons 
do meio, podemos fazer o ácido se associar ou se dissociar 
dependendo da concentração de prótons no meio, em outras palavras 
a concentração relativa de base conjugada e de ácido conjugado esta 
relacionada com a concentração de prótons no meio. 
Essa relação entre a concentração de base e ácido conjugado em dependência da 
concentração de prótons no meio pode ser predita de forma precisa através da equação de 
Henderson-Hasselbalch que pode ser deduzida a partir da constante de equilíbrio. 
Equação de Henderson-Hasselbalch 
A equação de Henderson-Hasselbalch define a relação entre pH e as concentrações do ácido 
e da base conjugada 
A alteração na concentração de qualquer componente de uma reação em equilíbrio provoca 
uma mudança na concentração de todos os componentes. 
 
Á ⇌ + + 
 
O aumento na concentração de H
+ 
irá diminuir a concentração da base conjugada com um 
aumento equivalente do ácido conjugado. 
Esta relação é convenientemente expressa pela equação de Henderson-Hasselbalch, que 
pode ser deduzida a partir da constante de equilíbrio. 
 
 =
[ + ] [ ]
[Á ]
 
Rearranjando a equação acima, temos: 
 
 
[ +]
=
 
 
 .
[ ]
[Á ]
 
 
Usando o logaritmo em ambos os lados da equação 
 
 
 
[ +]
=
 
 
+ 
[ ]
[Á ]
 
 
Como pH = log 1/ [H+] e pK = log 1/Keq 
 
 
 
 
A reação de ácido e base é reversível e a proporção do ácido e da base conjugada pode ser 
alterada se alterarmos a concentração de prótons no meio. 
𝑎𝐴 + 𝑏𝐵 ↔ 𝑐𝐶 + 𝑑𝐷 
 
𝒑𝑯 = 𝒑𝑲 + 𝒍𝒐𝒈 
[𝑩𝒂𝒔𝒆 𝑪𝒐𝒏𝒋𝒖𝒈𝒂𝒅𝒂]
[Á𝒄𝒊𝒅𝒐 𝑪𝒐𝒏𝒋𝒖𝒈𝒂𝒅𝒐]
 
 
Vivian Rocha 
 
16 
 
Titulação do Ácido Acético – Um Ácido Orgânico Fraco
A curva abaixo é uma curva de titulação de um ácido orgânico fraco, o ácido acético. 
A curva de titulação é feita da seguinte maneira: Em um becker é adicionado uma 
quantidade de água onde é dissolvida uma determinada quantidade de um ácido fraco que irá se 
dissociar ate atingir o equilíbrio, a razão entre o ácido conjugado e a base conjugada naquela 
solução vai depender do pK do ácido. 
No momento que é adicionado uma quantidade de um ácido forte como o HCl (ácido 
clorídrico), a concentração de prótons aumenta com isso a reação desloca o equilíbrio para a 
esquerda, portanto nesse momento inicial 100% do ácido estará sob a forma de ácido conjugado e 
não vai haver base conjugada, a partir desse ponto é adicionando um medidor dentro da solução, e 
são adicionadas quantidades conhecidas de uma base forte como o NaOH. O pH será medido após 
cada adição da base. 
Com isso são obtidos uma serie de pontos a 
partir dos quais é possível traçar uma curva 
semelhante a esta ao lado chamada de Curva de 
 que apresenta 3 regiões principais. Titulação
 A esta localizada do lado primeira região
esquerdo do gráfico, onde o pH da solução é muito 
baixo e por tanto a concentração de prótons é muito 
alta a adição da base forte faz o pH da solução variar 
abruptamente. 
 A da curva onde a adição de segunda região
quantidades de base agora produzem um pequeno aumento, essa região central demarcada em 
vermelho (retângulo) ganha uma denominação especial que é uma faixa de tamponamento. 
A da curva onde novamente a adição de quantidades conhecidas de base terceira região
voltam a fazer o pH variar bruscamente. 
É possível explicar esse três comportamentos diferentes da curva da seguinte maneira: 
No momento inicial que vai de 2 a 4,1 (aproximadamente) a concentração de prótons é 
grande, a base forte que é adicionada se dissocia em Na
+ 
e OH
-
 e se associa aos prótons do meio 
formando água, a quantidade de prótons será reduzida de forma estequiométrica em relação à 
quantidade de base que foi adicionada, como a concentração de prótons reduz vai haver um 
aumento do pH. A concentração de prótons residual continua grande o suficiente para manter a 
reação de associação do ácido ainda toda deslocada para esquerda, isso ocorre na 1
o
, 2
o
, 3
o
 e 4
o
 
adição. Apos o quarto ponto (parte vermelha) a concentração de prótons vai diminuir 
gradativamente e se torna pequena o suficiente para na próxima vez que for adicionada mais 
quantidades de base, esta se dissociar e o OH
-
 vai se associar com próton formando mais água, mais 
como a partir desse momento a concentração de prótons já esta muito pequena essa reação se 
desloca para direita gerando prótons, então parte dos prótons que foram consumidos pela associação 
com a base será resposta pela dissociação do ácido isso ocorre no 5
o
, 6
o
, 7
o 
e 8
o
. No ponto 9
o
 volta a 
variar bruscamente, pois todo o ácido foi transformado em base e da próxima vez que for 
adicionada mais base, ele vai retirar o próton do meio e não vai ter mais como ele ser reposto, então 
vai haver uma segunda fase onde o pH do meio volta a variar bruscamente. 
Gráfico 1- Curva de titulação pH 
Vivian Rocha 
 
17 
 
Na inicio como mostrado pela equação todo ácido acético, que neste caso foi o ácido usado 
para a titulação, esta sob a forma de ácido conjugado isso ocorre do pH 0 ate o pH 2. A partir dessa 
região o ácido conjugado começa gradativamente a se dissociar de 100% até 0% e nesse intervalo 
ele vai sendo gradativamente convertido à base conjugada. 
Cada vez que é encontrado um platô na curva de titulação isso indica que ha um efeito de 
tamponamento e consequentemente ha a dissociação de ácido fraco, se nesta curva fossem 
encontrados dois platôs, haveriam dos grupamentos ácidos sofrendo dissociação em pHs diferentes. 
O curioso é que na primeira região só há ácido conjugado, na terceira só a base conjugada e 
no ponto central ha uma mistura equimolar do ácido e da base conjugada, nesse pH 4,74 que é a 
região central do platô, existem concentrações iguais do ácido e da base conjugada, e esse pH de 
4,74 será igual numericamente ao pK e isso pode ser visualizado pela fórmula de Henderson-
Hasselbalch. 
Para o pH e o pK serem iguais as concentrações de ácido e base conjugada precisam 
ser iguais, pois é nesse ponto é onde temos concentrações equimolares do ácido e de sua 
base conjugada. 
Existe outra maneira de representar a curva de titulação. Onde ao em vez de haver variação 
do pH, irá haver a variação da forma ácida e da base conjugada em função do pH. 
Por esse gráfico é possível observar que em pHs 
muito baixos próximo a 0 todo o ácido esta forma de 
ácido conjugado e aqui 0% das moléculas estão sob a 
forma de base conjugada, a partir de certo ponto a 
concentração de ácido começa a diminuir e o número de 
molécula que desaparece na curva preta aparece na 
curva de baixo (vermelha), pois uma vez que 
dissociamos o ácido ele aparece na forma de base 
conjugada. Vai haver uma diminuição gradativa do 
ácido conjugado ate que em um pH alto o suficiente ele 
passa a não existir mais em solução e esse 
desaparecimento vai corresponder ao aumento da concentração da base conjugada que a partir de 
um determinado pH será a única forma presente. No ponto onde as linhas se cruzam a concentração 
do ácido é igual a da base e pela equação esse ponto corresponde ao pK daquele ácido. 
Caso da Aspirina 
Essas características de ácido e base e o fato dessa dissociação ser reversível são importantes 
para entenderemos certos medicamentos. Um exemplo disso é a aspirina que é o ácido 
acetilsalicílico, um ácido fraco, onde a proporção entre o ácido conjugado e a base conjugada irá 
depender da concentração de prótons. 
Quando aspirina é digerida, esta ira passar por dois órgãos: o estomago que possui pH 2 isso 
quer dizer que a concentração de prótons no estomago é alta consequentemente a forma 
predominante é a de base conjugada, depois a aspirina irá para o intestino onde é o pH 6,5 onde a 
concentração de prótons é pequena então a forma predominante neste local é de ácido conjugado. 
Não existe transportador de aspirina no organismo dos animais, com isso esta precisa entrar 
no organismo através de um processo que é chamado de difusão simples, ou seja, ela precisa passar 
diretamente pela membrana mais sem auxilio de transportadores. A aspirina precisa se dissolver na 
região hidrofóbica da membrana para alcançar o interior da célula, a substância só pode fazer isso 
Gráfico 2- Curva de Titulação. 
Vivian Rocha 
 
18 
 
se ela possuir característica hidrofóbica ou se ela não for polar. Uma das formas da aspirina não 
consegue atravessar a membrana porque ela tem uma carga negativa e outra consegue porque ela 
não apresenta carga. Nesse sentido a aspirina é absorvida pelo organismo no estômago. 
Outros medicamentos que foram feitos para serem absorvidos no intestino possuem uma 
capsula de gelatina que se desfazer no intestino. 
Formas Iônicas e Ponto Isoelétrico 
A estrutura geral dos aminoácidos possui pelo menos dois grupamentos ácidos na molécula: 
um grupamento amino e um carboxílico. Alguns aminoácidos além de possuírem esse dois 
grupamentos ácidos possuem um terceiro grupamento ácido na cadeia lateral, como é o caso dos 
aminoácidos do quadro da página 19. 
Pelo quadro, qual é o grupamento ácido mais forte, o grupamento carboxílico ou a hidroxila 
fenólica da Tirosina? O grupamento carboxílico é o ácido mais forte porque tem um pKa menor, em 
função de quanto menor é o pKa mais forte é o ácido. 
A acidez do grupamento carboxílico e do grupamento amino são mutuamente influenciados. 
A proximidade
do grupamento carboxílico faz com que o grupamento amino seja um ácido 
ligeiramente mais forte e a proximidade desse grupamento 
amino faz com que o grupamento carboxílico se torne um 
ácido ligeiramente mais forte. 
Isso quer dizer que se o aminoácido apresentar um 
grupamento amino ou carboxílico em sua cadeia lateral isso 
faz com que este, se torne um ácido mais fraco. 
Um aminoácido que possui apenas o grupamento alfa 
amino e alfa carboxílico pode existir em 3 formas iônicas 
diferentes um que tem carga líquida positiva, outro com 
carga líquida 0 e um com carga líquida negativa e essas 
formas iônicas vão ser dependentes do pH do meio. Em pH 
muito ácido, ou seja, em uma concentração de prótons muito 
grande o equilíbrio da reação é todo deslocado para a 
esquerda, o grupamento carboxílico fica protonado, sem carga o grupamento alfa amino fica 
protonado com carga positiva, à medida que 
o pH aumenta o grupamento ácido mais forte 
se dissocia e fica com carga negativa e 
grupamento amino mantém a sua carga. Se o 
pH é aumentando 
mais ainda a concentração de prótons cai mais e o segundo grupamento 
ácido começa a se dissociar passando de uma forma iônica para outra 
que tem o grupamento amino e o grupamento carboxílico dissociado. O 
grupamento carboxílico com carga negativa o grupamento amino 
dissociado com carga 0 e a carga líquida desse forma é -1. 
Ao lado se encontra a curva de titulação da Glicina, um 
aminoácido que contem apenas um grupamento alfa carboxílico e um 
grupamento alfa amino. O exemplo da Glicina é o exemplo de quase 
todos os aminoácidos, pois a maioria deles só apresenta o grupamento 
Tabela 3- pKa das Cadeias Laterais de 
Alguns Aminoácidos. 
Figura 6 - Formas Iônicas. 
Figura 7 - Curva de 
Titulação da Glicina. 
Vivian Rocha 
 
19 
 
alfa carboxílico e o grupamento alfa amino com característica ácida. 
Essa curva de titulação apresenta duas regiões de platô, ou seja, duas regiões de 
tamponamento o que indica que essa molécula apresenta dois grupamentos ácidos que estão se 
dissociando, o que leva ao efeito tamponante. 
Na primeira região de tamponamento ha a dissociação do grupamento ácido mais forte, 
então em pH menor vai dissociar primeiro o ácido mais forte que é a carboxila. A segunda região de 
tamponamento corresponde à dissociação do segundo grupamento ácido que é o grupamento amino. 
Ao longo desta curva de titulação a Glicina passará por estas formas iônicas indicadas acima da 
figura. 
Com isso quando ha variação do pH do meio a Glicina pode estar carregada positivamente 
(+1), com carga líquida 0 ou na forma líquida com carga negativa (-1) dependendo do meio. 
Outro conceito interessante que é extraído dessas moléculas que apresentam grupamentos 
carregados com cargas opostas é o (pI) que é definido como o pH do meio onde ponto isoelétrico
100% das moléculas tem carga líquida 0. 
Observando esta curva de titulação em que condição ou qual região da curva esse 
aminoácido (Glicina) tem carga líquida 0? Na região central, pois a molécula esta na forma iônica 
onde todo grupamento carboxílico esta dissociado, mais que nenhum 
dos grupamentos alfa amino começou a se dissociar, isso ocorre 
somente depois do pK1 que é o pK de dissociação do grupamento alfa 
carboxílico e antes do pK2 que é o pK de dissociação do grupamento 
alfa amino, ou seja, essa condição ocorre entre os dois pK. 
Uma forma prática para saber qual é o pH onde a sua molécula 
esta no ponto isoelétrico é fazendo a media aritmética dos dois pK assim 
é possível determinar um ponto equidistante tanto do pK1 quanto do pK2. Essa forma de calcular o 
pI (ponto isoelétrico) é valida para a maioria dos aminoácidos exceto 
para aqueles aminoácidos tem um segundo grupamento carboxílico 
ou amino na cadeia lateral que é o caso do Ácido Aspártico, ácido 
glutâmico, Lisina, Arginina e Histidina. 
Nesse caso vamos utilizar como exemplo a curva de titulação 
do ácido glutâmico. 
No momento inicial todos os aminoácidos estão nessa 
primeira forma iônica à medida que a base é adicionada a 
concentração de prótons diminui e os grupamentos ácidos começam 
a se dissociar. O primeiro grupamento a se dissociar é o grupamento 
ácido mais forte que é o grupamento alfa carboxílico, depois se 
dissocia o segundo grupamento ácido mais forte que é o grupamento 
carboxílico da cadeia lateral e depois se dissocia o terceiro 
grupamento ácido que é o grupamento alfa amino. 
Essas moléculas conforme forem se dissociando passam da 
primeira forma iônica do desenho para a última. O ácido 
Glutâmico pode existir sob quatro formas iônicas diferentes 
dependendo do pH, ou seja, ela pode existir na forma com carga 
líquida +1, com carga líquida 0, carga líquida -1 e carga líquida -
2. A forma correspondente ao ponto isoelétrico é a forma com 
Figura 8 - Cálculo do pI. 
Figura 9 - Curva de Titulação 
do Ácido Glutâmico . 
Figura 10 - Cálculo do pI do Ác. 
Glutâmico. 
Vivian Rocha 
 
20 
 
carga líquida 0. É necessário para que esta forma iônica exista, que o grupamento alfa carboxílico 
tenha se dissociado completamente e que nem o grupamento alfa amino e nem o grupamento 
carboxílico da cadeia lateral tenha se dissociado. Essa forma iônica existe onde na região da curva 
depois do pK1 e antes do pK2. Nesse caso o pI é calculado através da media aritmética dos dois 
pKs dos grupamentos semelhantes. 
O grupamento alfa carboxílico é um ácido mais forte do que o grupamento carboxílico da 
cadeia lateral devido à proximidade desse grupamento carboxílico com um grupamento alfa amino. 
A mesma coisa ocorre com o aminoácido que possui um segundo grupamento amino na 
cadeia lateral é o caso, por exemplo, da Lisina. 
À medida que a base é adicionada e a concentração de prótons 
diminui os grupamentos vão gradativamente se desprotonando, 
primeiro desprotona o grupamento alfa carboxílico, depois o 
grupamento alfa amino e por último o grupamento amino da cadeia 
lateral. Nesse sentindo dependendo do pH, pode existir quatro forma 
iônicas da Lisina que vão possuir carga líquida +2,+1, carga líquida 0 
ou carga líquida -1. A forma existente no ponto isoelétrico é a com 
carga líquida 0. O que precisa ocorrer na curva de titulação para a 
Lisina chegar à forma do ponto isoelétrico? Precisa dissociar o 
grupamento alfa carboxílico e o alfa amino e não dissociar o 
grupamento amino da cadeia lateral. Então essa forma iônica existe 
depois do pK1 e do pK2 e antes do pK3. Então o ponto isoelétrico da 
Lisina esta localizado entre o pK2 e o pK3. O pI desse aminoácido é 
corretamente calculado fazendo a media aritmética dos pK2 e 
pK3. 
Quando um aminoácido apresenta um grupamento 
carboxílico e dois grupamentos aminos o pI é calculado através 
da media aritmética entre os pK dos grupamentos semelhante 
Na tabela abaixo estão descritos os pK dos 
grupamentos alfa carboxílicos de vários aminoácidos e o pK dos grupamentos alfa aminos de vários 
aminoácidos e pK dos grupamentos ácidos da cadeia 
lateral de alguns aminoácidos. Mesmo em relação aos 
grupamentos alfa carboxílicos e os grupamentos alfa 
amino existe variação de pK, indicando pequenas 
variações de acidez nos grupamentos amino e 
carboxílico nos diferentes aminoácidos. Essas 
pequenas variações de acidez não são dadas pelo 
grupamento carboxílico e pelo grupamento amino são 
dadas pela estrutura da cadeia lateral. Com isso a 
estrutura da cadeia lateral também influência a acidez 
dos grupamentos alfa carboxílicos e amino. Isso é 
importante porque mesmo aminoácidos que 
apresentem apenas um grupamento carboxílico e um 
grupamento amino, podem apresentar diferentes estados
iônicos em determinados pH e 
consequentemente essa diferença de estado iônico ajuda na separação destes. 
Tabela 4 - Valores dos pKas. 
Figura 11 - Curva de Titulação 
da Lisina. 
Figura 12 - pI da Lisina. 
Vivian Rocha 
 
21 
 
AULA 3 - TÉCNICAS DE FRACIONAMENTO DE 
AMINOÁCIDOS 
A palavra fracionamento significa separação. Antes de falarmos do fracionamento 
propriamente dito, vamos explicar as metodologias e em que condições elas poderiam ser aplicadas. 
Para que Servem as Técnicas de Fracionamento de Aminoácidos? 
Essas técnicas podem ser utilizadas para determinar: o tipo e a abundância de cada tipo de 
aminoácido presente, por exemplo, em um determinado tipo de alimento. Nesse sentido é possível 
determinar os tipos de aminoácidos presentes nesse alimento e a quantidade com que ele se 
apresenta, determinando assim se este alimento é rico ou não em aminoácidos essenciais. 
Essas técnicas também podem ser usadas para determinar os tipos e a abundância de cada 
aminoácido nos fluidos biológicos como, por exemplo, o plasma sanguíneo e o líquido 
cefalorraquidiano. E essas informações são utilizadas para diagnosticar possíveis anormalidades 
metabólicas. 
Outra aplicação dessas técnicas de fracionamento é a investigação da presença de 
aminoácidos e de outras substâncias de origem biológica em meteoritos de origem extraterrestre. 
E uma ultima aplicação seria a utilização dessas técnicas para determinar os tipos e a 
abundância deles em uma determinada proteína. 
Metodologias de separação 
As técnicas de fracionamento são baseadas nas diferenças de propriedades físico-químicas 
existentes entre os aminoácidos, que consistem basicamente na cadeia lateral. 
Cada tipo de aminoácido possui uma cadeia lateral com uma estrutura característica, e estas 
possuem diferentes propriedades de solubilidade em um ambiente aquoso. E com isso temos 
aminoácidos com cadeias laterais com característica hidrofóbica, ou seja, tem pouca solubilidade 
em ambiente aquoso e aminoácidos com cadeias laterais que possuem características polares. 
Dentre esses aminoácidos com cadeias laterais polares alguns são mais polares como Ácido 
Aspártico, ácido glutâmico, Lisina, Arginina e Histidina do que outros. 
A primeira forma de diferenciar um aminoácido do outro e utilizar isso para promover a 
separação dessas moléculas é a característica de solubilidade da cadeia lateral em um solvente polar 
ou apolar. A segunda característica que pode ser utilizada para promover a separação desses 
aminoácidos é a diferença de cargas, devido a diferença entre os pKs dos grupamentos alfa 
carboxílicos e dos grupamentos alfa aminos entre os diferentes aminoácidos que é devido a 
influência da estrutura da cadeia lateral sobre a acidez desses grupamentos. 
Por outro lado na própria cadeia lateral também existe alguns grupamentos que tem 
característica ácida. Devido a acidez desses grupamentos e as diferenças de pKs desses 
grupamentos ácidos entre os diferentes aminoácidos, temos que em um determinado pH cada tipo 
de aminoácido possui uma estrutura iônica distinta. E essas diferenças na carga dos aminoácidos 
também podem ser utilizadas para promover a separação dessas moléculas. 
Então basicamente as técnicas de fracionamento se baseiam nas diferenças de polaridade 
da cadeia lateral e nas diferenças de cargas dos aminoácidos. 
Vivian Rocha 
 
22 
 
Com base na exploração dessas diferenças temos uma serie de metodologias como: a 
cromatografia em papel, cromatografia de troca iônica, eletroforese e a cromatografia líquida de alta 
eficiência que explora uma característica ou outra do aminoácido para promover a separação. 
Técnicas de Fracionamento 
Uma grande variedade de técnicas modernas, tanto analíticas quanto preparativa, é 
denominada de cromatografia. 
Existem quatro tipos principais de cromatografia: cromatografia líquida, cromatografia 
gasosa, cromatografia de camada fina e cromatografia em papel. 
O que os diferentes tipos de cromatografia possuem em comum é a propriedade de 
fracionar uma mistura complexa de substâncias com base na diferença de características 
químicas entre os componentes da mistura. Estas diferenças fazem com que os componentes da 
mistura interajam de forma diferencial com as fases do sistema cromatográfico, causando a 
separação dos componentes. 
Cromatografia em papel: Nesta técnica, o principal fenômeno responsável pela 
separação das substâncias é o entre duas fases imiscíveis, formadas por uma fenômeno de partição
mistura de um solvente pouco polar e um solvente polar. 
Cromatografia de Troca Iônica: A cromatografia de troca iônica é um método de 
fracionamento baseado na a um suporte que contém uma carga fixação de substâncias carregadas
oposta. A separação é possível por que as interações eletrostáticas são reversíveis e dependentes da 
afinidade de cada substância pelo trocador. Essa afinidade é função do pH do meio, da 
, etc. temperatura, da força iônica do tampão
Eletroforese: Esta técnica é baseada na (moléculas) carregadas, migração de partículas
positivamente ou negativamente, quando sujeitas a ação de um campo elétrico. 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE): Sistema moderno de 
cromatografia que utiliza a injeção das amostras e do solvente em colunas cromatográficas sob alta 
pressão. Dependendo do tipo de coluna, pode realizar a separação de moléculas utilizando 
diferentes propriedades físico-químicas (partição, adsorção, troca iônica, etc.). 
Cromatografia em Papel Monodimensional 
A cromatografia em papel é baseada no principio de partição que esta relacionado com as 
diferenças de polaridade nas cadeias laterais, pois cada aminoácido caracteriza-se por possuir uma 
cadeia lateral com diferentes graus de hidrofobicidade. 
Essa técnica de cromatografia esta em desuso, porém este conceito de separação é utilizado 
para outras técnicas mais modernas como a cromatografia líquida de alta eficiência. Além disso, 
essa cromatografia por ser relativamente barata e por não requerer treinamento 
sofisticado do operador, ainda é largamente utilizada em laboratórios de analises 
clínicas para diagnosticar determinados tipos de doenças, que tem como 
característica presença de níveis elevados de aminoácidos ou alguma outra 
substância no fluido biológico. 
O principal fenômeno responsável pela separação das substâncias é o 
fenômeno de partição que ocorre entre duas fases imiscíveis formadas por uma 
mistura de solventes, onde um solvente possui característica pouco polar e o outro 
é polar. Figura 13 - Funil 
de Partição. 
Vivian Rocha 
 
23 
 
A utilização mais familiar dessa 
cromatografia é o Funil de Partição, onde ha a 
seguinte situação: Uma mistura de solventes 
imiscíveis, onde é possível ver claramente a 
separação entre um solvente que esta localizado 
na parte inferior e o outro esta na parte superior, 
que é dada pela dissolução diferencial de um 
determinado composto que prefere se dissolver 
na fase inferior que possui a polaridade 
semelhante a sua. Se a molécula for uma 
substância hidrofóbica, quer dizer que o solvente 
inferior tem característica hidrofóbica e 
consequentemente o solvente superior tem a 
característica hidrofílica. 
Essa partição diferencial pode ser calculada através de um 
coeficiente partição ou coeficiente de distribuição que é calculado dessa forma: 
 
 
 
Ou seja, medimos a concentração do composto X no solvente A e coloca no numerador, 
mede a concentração composto X no solvente B e coloca no denominador e divide um número pelo 
outro. 
Nessa cromatografia exploramos principalmente a diferença de polaridade entre os 
aminoácidos que é dada principalmente pela
cadeia lateral. 
Se possuirmos uma estrutura de cadeia lateral muito hidrofóbica como é o caso das cadeias 
laterais da Isoleucina, Prolina ou Metionina, que vencem a tendência dos grupamentos alfa 
carboxílicos e alfa amino de interagirem com a água, com isso estes aminoácidos vão estar 
predominantemente presentes na fase apolar. Por outro lado as moléculas possuem cadeias laterais 
com características hidrofílicas, estas vão possuir a tendência de interagir com a água e vão 
contribuir para aumentar a capacidade dos grupamentos alfa carboxílicos e alfa amino de 
interagirem com o ambiente aquoso. 
Então na realidade apesar de todos os aminoácidos, mesmo os hidrofóbicos, poderem ter 
carga negativa ou positiva dependendo do pH, essa polaridade dos grupamentos é neutralizada pela 
grande hidrofobicidade da cadeia lateral. 
Nesse caso substâncias podem ter um coeficiente de partição que fazem com que elas 
fiquem dissolvidas preferencialmente no solvente A ou preferencialmente dissolvidas no solvente 
B. 
Esse sistema de partição líquido - líquido foi utilizado durante muito tempo para fazer o 
fracionamento de substâncias inclusive de aminoácidos. 
Esse sistema de separação era uma técnica muito demorada e trabalhosa, pois é preciso 
repetir a separação varias vezes e em cada uma dessas vezes era perdida um pouco da substância de 
interesse. 
Para os cientistas que trabalhavam com química de proteínas esse procedimento era 
desvantajoso, pois eles conseguiam uma quantidade muito reduzida de proteínas. Então eles 
bolaram uma nova forma de fazer esta separação. 
𝐶𝑜𝑒𝑓.𝑑𝑒 𝑃𝑎𝑟𝑡𝑖çã𝑜 =
𝐶𝑜𝑛𝑐.𝑑𝑒 𝑋 𝑛𝑜 𝑆𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 𝐴
𝐶𝑜𝑛𝑐.𝑑𝑒 𝑋 𝑛𝑜 𝑆𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 𝐵
 
 
Vivian Rocha 
 
24 
 
Nessa nova forma de realizar a separação, eles continuavam com duas fases uma hidrofóbica 
e uma hidrofílica, só que ao em vez de um sistema líquido-líquido temos um sistema sólido-líquido 
com uma fase polar e outra apolar, o truque foi imobilizar uma das fases, a fase hidrofílica, que 
agora é representada pelas fibras de celulose de uma folha de papel ao redor da qual se forma 
camadas de solvatação contendo moléculas de água. 
Nessa folha de papel constituída principalmente de 
fibras de celulose e ao redor de cada fibra de celulose 
existiam varias moléculas de água rodeando aquela fibra 
formando a camada de solvatação. Então a sua fase 
hidrofílica estava imobilizada em uma folha de papel. Por 
outro lado tínhamos a fase hidrofóbica que era uma fase 
móvel e que se movia por capilaridade por entre os poros da 
fibra de papel. 
A substância interesse agora precisa “escolher” entre ficar em uma cavidade que possui 
característica hidrofóbica ou ficar ligada a fibra de celulose que tem característica hidrofílica. Assim 
o fenômeno de partição vai ocorrer entre uma fase estacionaria hidrofílica que é a matriz do papel 
ou uma fase líquida que reveste as cavidades e que é móvel e hidrofóbica. 
A mostra é aplicada em uma das extremidades da folha de papel que é tocada em uma das 
suas extremidades pelo solvente que sobe por capilaridade. Se a molécula interagir com a fibra de 
papel ela ficará retida, se a molécula preferencialmente se dissolver naquelas cavidades à medida 
que o fluxo vai subindo ela vai sendo arrastada uma vez que ela não está agarrada a nada. 
Sendo assim teremos o arraste das substâncias que vão preferencialmente se dissolver na 
fase líquida e a retenção ou retardo das substâncias que preferem ficar ligadas as fibras de celulose. 
Por essa metodologia temos a separação de substâncias que apresentam característica 
polares e ficam retidas na matriz do papel, por tanto tem uma velocidade de migração lenta e de 
substâncias que possuem característica apolares que ficam preferencialmente não ligadas à fase 
estacionaria e são arrastadas pelo fluxo de solvente. 
O poder de resolução dessa cromatografia em papel é relativamente grande. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A migração relativa de cada aminoácido ao longo da fibra de papel que é dependente da sua 
solubilidade entre as duas fases, a móvel e a estacionaria, pode ser expressa por um fator que é 
chamado de ou . Fator de retardo Fator de retenção
 
 
 
 
Figura 14 - Cromatografia em Papel. 
Então como resumo disso temos que os diferentes aminoácidos podem ser separados 
por cromatografia em papel devido à solubilidade diferencial que essas moléculas 
apresentam entre a água de hidratação ou água de solvatação que existe ao redor das 
fibras de celulose que corresponde à fase estacionaria e a fase orgânica móvel que 
flui por entre as fibras da celulose que contem característica hidrofóbica ou apolar. 
Este fenômeno pode ser convenientemente expresso como um fator de retardo ou 
fator de retenção (Rf). 
 
Vivian Rocha 
 
25 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Em uma folha de papel você aplica 4 moléculas diferentes, 4 aminoácidos Exemplo:
diferentes, coloque-o a mistura de solvente e deixe fluir ao longo da folha de papel ate a região 
chamada de frente de solvente. Como cada aminoácido desses possui 
um coeficiente de partição distinto entre a fase móvel e a fase os 
estacionaria migram com velocidades diferentes. 
A molécula 1 que é mais polar migrou menos, o outro 
aminoácido que é mais apolar migrou mais e os outros dois 
aminoácidos que tem polaridade intermediaria migraram de forma 
intermediaria. A partir dessa migração você pode achar um fator de 
migração relativa, que é chamado de fator de retardo ou fator de 
retenção que é calculado dividindo distância entre o ponto de 
aplicação do aminoácido e o centro da banda cromatográfica, essa distância é coloca no numerador, 
dividindo essa distância pela distância de aplicação e a frente de solvente que fica no denominador. 
 
 
 
 
 
 
 
Esta divisão, sempre vai dar um número menor do que 1, que é a percentagem de migração 
do aminoácido em relação migração do solvente. Por essa consideração é possível observar que 
nenhum dos aminoácidos esta completamente dissolvido na fase móvel. 
Qual a necessidade de se calcular essa fator de retardo? A necessidade consiste no fato de 
que geralmente em laboratórios diferentes você utiliza folhas de papel ou tiras de papel de 
comprimentos diferentes. 
Então se você medir simplesmente a distância que o aminoácido migra não é uma 
informação muito util. Independente do tamanho da fibra de papel eles vão ter sempre o mesmo . 
Esses fatores de migração ou fatores de retardo são característicos de cada molécula. Você 
pode consultar em um atlas de bioquímica qual seria o do teu aminoácido ou dos aminoácidos 
em um determinado sistema de solvente e se você repetir o seu experimento cromatográfico 
Os diferentes aminoácidos podem ser separados por cromatografia em 
papel devido à solubilidade diferencial que apresentam entre a água de 
hidratação (solvatação) ao redor da das fibras de celulose (fase estacionária) e a 
fase orgânica móvel que flui por entre as fibras de celulose. 
A solubilidade relativa dos aminoácidos nestas duas fases pode ser 
alterada por mudanças na polaridade do solvente, ou no pH da solução, que irá 
alterar o estado iônico dos aminoácidos. 
Sob um conjunto controlado de condições, cada componente da mistura 
irá se deslocar com uma determinada velocidade e, após um período de tempo, 
estará a uma distância específica do ponto de origem, quando cessar o fluxo de 
solvente. 
Figura 15-Exemplo de 
Cromatografia em Papel. 
Figura 17- Cromatograma em 
Papel Monodimensional. 
Figura 16- Cálculo do Fator de 
Retenção. 
Vivian Rocha 
 
26 
 
utilizando as mesmas condições você
pode através do que você encontrar compará-lo com 
determinado da literatura e a partir dessa comparação é possível predizer que tipo de molécula seria 
aquela. Essa técnica não é 100% confiável uma vez que vários aminoácidos têm muito 
parecidos e não é possível garantir que um aminoácido seja igual ao outro simplesmente 
comparando os , só se você estiver utilizando aminoácidos com diferenças de muito 
grandes. 
Essa técnica de separação é uma , ou seja, você aplica sua técnica monodimensional
amostra em um ponto de origem e promove a separação da sua molécula em uma única dimensão. 
Existe outro tipo de cromatografia que a que utiliza duas cromatografia bidimensional
misturas de solventes diferentes aplicados de forma consecutiva para a separação de uma mistura de 
substâncias. 
Cromatografia em Papel Bidimensional 
Nesse procedimento é utilizado um quadrado de papel onde a amostra é aplicada em uma 
das quinas, essa extremidade do papel é tocada na mistura de solvente que começa a subir por 
capilaridade pelas fibras do papel, nesse procedimento as 
moléculas presentes no ponto de aplicação vão se separando 
formando machas cromatográficas distintas. Depois que essa 
primeira dimensão é dissolvida você retira o papel do solvente 
seca e o papel seco é girado em 90
o
 graus e é colocado em 
contato com um segundo solvente que migra por capilaridade e 
vai se deparar novamente como as moléculas que já tinham sido 
separadas na primeira dimensão, como o segundo solvente e 
diferente do primeiro, aquelas moléculas vão migrar de forma 
diferencial. Com isso se na primeira dimensão era possível 
observar apenas três componentes diferentes a separação 
utilizando as duas misturas de solventes de forma consecutiva produziu uma resolução melhor, 
sendo então possível detectar que na realidade a sua mistura continha 4 substâncias diferentes ou 
quatro aminoácidos diferentes. 
Eritrócito Falciforme 
Uma técnica cromatográfica desse tipo foi utilizada para determinar a diferença existente 
entre a hemoglobina de um eritrócito normal e a hemoglobina de um eritrócito falciforme. Hoje em 
dia todo mundo sabe que na realidade a diferença 
entre esses dois tipos de eritrócitos é uma mutação 
na cadeia beta da hemoglobina, que causa anemia 
falciforme. Essa mutação substitui uma ácido 
glutâmico por uma Valina no sexto aminoácido 
dessa cadeia. 
Como o ácido glutâmico possui uma cadeia 
lateral com carga negativa e a Valina apresenta uma 
cadeia lateral sem carga com característica hidrofóbica. 
Essa mutação foi à primeira detectada na estrutura de uma proteína por volta de 1943 
utilizando cromatografia em papel. 
Figura 18- Cromatografia em Papel 
Bidimensional. 
Figura 19- Cadeia Beta da Hemoglobina de um 
Eritrócito Normal e um Falciforme. 
Vivian Rocha 
 
27 
 
Os pesquisadores isolaram a cadeia beta da hemoglobina de um individuo normal e de um 
individuo com anemia falciforme. Essas cadeias foram tratadas com uma serie de proteases sítio 
específicas, como a , que corta depois dos aminoácidos Arginina e Lisina, a , tripsina quimiotripsina
que corta depois de Triptofano, Tirosina e Fenilalanina, e por ultimo uma protease que cortar 
somente depois de Glicina ou Valina. 
Essas misturas de peptídeos da hemoglobina normal e da hemoglobina falciforme foram 
separadas por cromatografia bidimensional. E com isso foi possível observar que o padrão de 
distribuição dos peptídeos era praticamente idêntico à única diferença marcante foi um peptídeo 
presente na hemoglobina normal que estava ausente na hemoglobina falciforme, que por outro lado 
apresentava um peptídeo que não estava presente na hemoglobina normal. 
Acidez dos Aminoácidos 
A segunda característica dos aminoácidos que pode ser utilizada para diferenciar um 
aminoácido do outro esta relacionada com as propriedades ácidas dos grupamentos α-amino, α-
carboxílico e também quando houver grupamentos ácidos na cadeia lateral. 
Esses grupamentos α-carboxílico ou grupamento carboxílico, quando presentes na cadeia 
lateral, podem existir no estado sem carga ou com carga negativa e o grupamento α-amino e o 
grupamento amino, da cadeia lateral, podem existir no estado com carga positiva ou sem carga. 
Essas diferenças de cargas, projetam estados 
iônicos diferentes a esse grupamentos, que 
são dependentes primeiro do pKa daquele 
grupamento, que esta relacionado com a 
constante de equilíbrio daquele ácido e 
também com o pH do meio, isso quer 
dizer que dependendo do pH aqueles 
aminoácidos podem estar com carga 
positiva, com carga líquida zero ou carga 
líquida negativa. Com isso essas diferenças 
de carga podem ser exploradas para separar 
esses aminoácidos por outras metodologias de 
fracionamento. 
Cromatografia de Troca Iônica 
Essa metodologia promove o fracionamento das moléculas presentes em uma determinada 
solução com base na fixação daquelas substâncias carregadas presentes na mistura a um suporte que 
contém carga oposta à da molécula que esta sendo fracionada, essa separação só é possível porque 
essas interações eletrostáticas que ocorrem entre a molécula que esta sendo fracionada e o suporte é 
reversível e é dependente da afinidade de cada substância pelo trocador, sendo essa afinidade em 
função do pH do meio que altera o estado iônico da substância e por tanto faz que fique mais 
fortemente aderida ou mais fracamente a aquelas cargas presentes no sistema cromatográfico. 
Também podendo ser em função da temperatura, pois esta afeta o pKa ou a acidez dos 
grupamentos e por tanto pode alterar o estado iônico da molécula e da força iônica do tampão, 
onde em uma alta concentração de íons, estes competem pela ligação com o trocador e podem não 
permitir a ligação da molécula de interesse. 
 
Vivian Rocha 
 
28 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
De uma maneira geral essa cromatografia de troca iônica é realizada em colunas 
cromatográficas que são suportes e geralmente ela é formada por uma coluna de vidro ou de resina 
sintética transparente, onde você tem uma parte superior que funciona como a entrada do fluxo de 
tampão que passa ao longo de todo sistema e sai na parte inferior. O interior da coluna é revestido 
com o trocador que geralmente consiste de pequenas esferas poliméricas formadas ou por polímeros 
naturais como a celulose e agarose ou polímeros sintéticos como a poliacrilamida ou o nylon e a 
estes polímeros vão estar ligados determinados grupamentos químicos que vão ter naquele pH carga 
positiva ou negativa. 
Esse trocador que preenche o leito da coluna é formado de esferinhas que possuem uma 
estrutura polimérica, ou seja, ela é porosa, formada por uma malha de polímeros. A esse polímero 
você adiciona um composto com carga positiva ou negativa e faz uma reação química para que este 
composto se ligue covalentemente à estrutura do polímero. 
Tendo um esquema semelhante a este a baixo, onde as esferinhas que formam um leito no 
interior da coluna estão embebidas em uma solução tampão de pH conhecido, essas esferinhas 
cheias de grupamentos carregados negativamente, nesse caso, ao qual vão se ligar moléculas com 
cargas positivas. Dependendo da composição da amostra pode ser que esta coluna com carga 
negativa não seja a melhor para promover a separação, neste caso você optar por utilizar um 
trocador tem grupamentos carregados positivamente na matriz. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Nesse caso onde temos as esferinhas carregadas negativamente a qual é aplicado uma 
mistura de substâncias com carga positiva e carga negativa, onde neste caso as moléculas com carga 
predominantemente positiva se ligam ao grupamento que esta
preso na esferinhas, fazendo com que 
essas moléculas com carga positivas fiquem retidas na coluna enquanto que aquelas moléculas com 
a mesma carga do trocador ou sem carga, por não conseguirem interagir com o grupamento 
carregado, são arrastadas pelo fluxo de solvente que esta passando ao longo da coluna. 
 
Figura 20- Coluna Cromatográfica 
Negativa. 
A cromatografia de troca iônica é um método de fracionamento 
baseado na fixação de substâncias carregadas a um suporte que contém uma 
carga oposta. 
A separação é possível por que as interações eletrostáticas entre os 
grupos são reversíveis e dependentes da afinidade de cada substância pelo 
trocador. 
Este fenômeno pode ser convenientemente expresso como um fator de 
retardo ou fator de retenção (Rf). 
Esta afinidade é função do pH do meio, da temperatura, da força 
iônica do tampão, etc. 
 
Vivian Rocha 
 
29 
 
Como a esfera é porosa quando você faz a reação química além dos polímeros expostos na 
superfície da esfera, todo o polímero no interior da esferinha também fica ligado a grupamentos 
com carga, então a área da esfera que possui moléculas capazes de fazer interações eletrostáticas 
não se restringe simplesmente à superfície mais também a toda área no 
interior da esfera. 
Nessa representação os filamentos verdes representam a 
molécula do polímero que faz ligações cruzadas com outros polímeros 
formando uma malha tridimensional, os grupamentos ligados 
covalentemente a estrutura do polímero possuem carga negativa e o 
líquido esta interagindo com essas moléculas carregadas da matriz que 
tem cargas positivas dentro das esferinhas amarelas. 
 
Na figura abaixo, esse primeiro grupo de grupamentos químicos que inclui, por exemplo, o 
grupamento que esta presente nessa resina do Dowex-50, possui um anel benzeno ligado a um 
grupamento sulfato que é um ácido forte, por tanto em 
qualquer pH ele esta carregado negativamente. A segunda 
estrutura apresenta um grupo carboxi-metil, esse 
grupamento carboxílico é um ácido fraco então essa carga 
negativa é dependente do pH e na ultima estrutura você tem 
dois grupamentos carboxílicos, por tanto ele é capaz de 
interagir mais fortemente com íons que estejam duplamente 
carregados e novamente 
esse grupamentos 
carboxílicos são ácidos 
fracos e por tanto essa 
carga negativa é 
dependente do pH. 
Nos dois 
exemplos abaixo da fig. 
22 (área verde) 
grupamentos apresentam cargas positivas, que é o dietil-amino-
etil que possui uma amina terciária, novamente o estagio iônico 
dele é dependente de pH e uma amina quaternária em baixo que 
possui carga positiva independentemente do pH em que ela 
esteja presente. 
Com isso existem esferas com grupamentos carregados 
negativamente ou então esferinhas com grupamentos 
carregados positivamente, podendo utilizar uma ou outra. 
Havendo somente um cosa onde é utilizada uma mistura das 
duas, no sistema de purificação de água, que serve para retirar 
completamente os íons da água. 
 A figura ao lado ao em vez de mostrar a coluna inteira 
estamos apenas ilustrando uma esfera, então a coisa funciona da 
seguinte maneira: Na primeira figura (figura a) a que esferinha
Figura 21- Malha do Polímero 
da Coluna de Troca Iônica. 
Figura 22 - Tipos de Resinas Sintéticas 
Usadas em Colunas de Troca Iônica 
Figura 23 - Funcionamento da 
Coluna de Troca Iônica. 
Vivian Rocha 
 
30 
 
vai conter os grupamentos carregados esta representada por uma esfera maior que tem coloração 
cinza, ligado covalentemente a matriz você tem o grupamento trocador que é representando pelas 
esferas menores de cor amarela que é o grupamento e que, portanto tem carga negativa e sulfato
dessa forma esta esferinha e capaz de liga e desligar íons com carga positiva. No momento inicial 
essa esferinha esta dentro da coluna embebida em uma solução tampão que tem o ácido e base 
conjugada, a base conjugada esta na forma salina e o sal da base pode formar uma interação 
eletrostática com o trocador. Então se temos, por exemplo, um sistema tampão formado por acetato 
sódio e ácido acético, o acetato é capaz de interagir com as cargas negativas do trocador. Nessa 
situação inicial é aplicada no topo da coluna uma solução contendo uma mistura de três 
aminoácidos que seria o , a Ácido Aspártico e a Serina (figura b). Esses aminoácidos Lisina
podem estar carregados negativamente, positivamente ou sem carga, se o objetivo é que todos os 
aminoácidos da mistura interajam com o trocador, estes estar na forma positiva, em função disso é 
preciso optar por um pH onde seja garantindo que todos os aminoácidos estejam carregados 
positivamente. 
Como vimos anteriormente no a carga líquida do aminoácido é zero. ponto isoelétrico (pI)
Se o pH é aumentado, ou seja, a concentração de prótons no meio é diminuída a carga líquida do 
aminoácido fica negativa e se o pH da solução for menor do que o pI a carga líquida do aminoácido 
fica positiva. Então para o nosso exemplo temos que escolher um pH menor do que o pI da , Lisina
da e do Serina , para que os três aminoácidos fiquem com carga positiva, fazendo Ácido Aspártico
com que todos se liguem a coluna. Mais para isso é preciso calcular o pI, pois somente assim é 
possível saber em um dado pH qual aminoácido esta com carga positiva e qual esta com carga 
negativa, predizendo assim seu comportamento durante a eletroforese ou na cromatografia de troca 
iônica. 
Quando os três aminoácidos estiverem ligados à carga do trocador o íon sódio que estava 
ligado é deslocado (figura b), nesse momento a coluna e lavada com bastante tampão para retirar 
aquelas moléculas que não possuem carga ou tenham a mesma carga da coluna, deixando no 
interior dela apenas os aminoácidos com carga oposta a carga do trocador. 
Não adianta nada fazer uma técnica de fracionamento se o produto desejado esta no interior 
da coluna, com isso é preciso mudar as condições do meio de tal forma que aquelas moléculas se 
soltem do trocador. Preferencialmente você deve fazer isso de forma gradativa, elaborando uma 
forma de eluição onde cada um dos aminoácidos se solte em uma condição diferente. 
Existem duas formas de fazer isso a primeira forma é variando o pH o que faz com que a 
forma iônica do trocador mude e consequentemente muda a forma iônica do aminoácido fazendo 
com que ele se solte da coluna. 
 
 
 
 
Então se aminoácido esta carregado positivamente e o pH do meio é aumentado e vai chegar 
em um determinado pH onde o Ácido Aspártico perde a carga e começa a se soltar (figura c), mais 
nesse pH que faz com que o fique com carga líquida zero a Ácido Aspártico e a Serina Lisina
ainda estão carregadas positivamente continuando retidos na coluna, se novamente o pH é 
aumentado ele chega ao pI da que perde a carga e se solta da coluna (figura d), mais neste Serina
Neste caso quando maior a diferença entre o pH e o pI mais 
forte o aminoácido se liga a coluna e quanto menor é essa diferença 
mais facilmente ele se solta. 
Vivian Rocha 
 
31 
 
pH a ainda esta carregada positivamente. Aumentando mais o pH vai chegar ao pI da Lisina Lisina
que perde a carga e se solta (figura e). 
Essa eluição também pode ser feita aumentando a concentração de sal ao em vez de 
aumentar o pH, Por exemplo se aumentarmos a concentração de cloreto do sódio, o número de 
moléculas de sódio na solução vai aumentar e ela vai tender a deslocar os aminoácidos que estão 
ligados ao trocador e novamente a ordem de eluição é obedecida: primeiro o , Ácido Aspártico
depois a e então a Serina . Lisina
Abaixo segue um esquema de eluição com três picos que foram eluídos em frações 
diferentes.
Uma única coluna cromatográfica pode fazer a 
separação de todos os aminoácidos presentes nas 
proteínas. Nesse exemplo temos a adição de uma 
estrutura complexa de aminoácidos e uma coluna 
trocadora de cátions, ou seja, coluna com carga negativa 
que liga e desliga íons com carga positiva e elaborando 
um procedimento de eluição com pHs gradativamente 
maiores é possível seletivamente eluir em frações 
separadas praticamente todos os aminoácidos 
normalmente encontrados nas proteínas. 
O volume de eluição é relativamente grande e esse procedimento é relativamente demorado 
por volta de 24 horas para fazer a analise completa e é possível observar que os picos de eluição são 
relativamente abertos tendo uma resolução muito grande, de tal forma que se dois aminoácidos 
estiverem próximos um do outro podemos confundir e ver estes dois aminoácidos como apenas um. 
Eletroforese 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A força friccional é dependente do tamanho da molécula, portanto partículas com a mesma 
carga podem ter tamanhos diferentes, com isso uma partícula menor se desloca mais rapidamente 
do que uma partícula maior, em função do atrito que ela sofre ser menor. 
A eletroforese é um método de fracionamento baseado na migração de 
partículas carregadas, positivamente ou negativamente, quando sujeitas à ação 
de um campo elétrico. 
Os cátions migrarão para o catodo (pólo negativo) 
Os ânions migrarão para o anodo (pólo positivo) 
A velocidade de migração destes íons dependerá do equilíbrio entre a 
força eletromotriz do campo elétrico (voltagem) e da força retardante (em geral 
do tipo friccional ou eletrostática) imposta pelo meio em que ocorre a 
eletroforese. 
Os suportes comumente usados para a eletroforese são: 
 Papel 
 Acetato de Celulose 
 Amido 
Figura 24 - Esquema de Eluição do Ácido 
Aspártico, da Serina e da Lisina. 
Vivian Rocha 
 
32 
 
Outro tipo de força que pode retardar a movimentação desses íons são as forças 
eletrostáticas, imaginem que essas partículas estão migrando por uma matriz que apresenta carga 
negativa ou positiva e que interagem com os íons e enquanto isso ocorre estes se tornam incapazes 
de migrar pelo campo elétrico. 
Nesse sentido moléculas que sofrem o mesmo retardo friccional durante a migração e que 
não interagem de forma significativa com a matriz, apresentam velocidades de migração que vão 
depender de duas coisas: 
 Voltagem - Quanto maior a voltagem, maior a velocidade migração. 
 Carga do aminoácido 
Logo abaixo esta ilustrado o mecanismo de 
eletroforese, onde em dois tanques contendo o 
mesmo tipo de solução tampão em um 
determinado pH é estendida folha de papel 
fazendo uma ponte entre os dois pólos (catodo 
que e o pólo negativo e o anodo que é pólo 
positivo), depois de aplicada a mistura de 
aminoácidos no centro da folha de papel, sendo 
este todo embebido em uma solução tampão. A 
maquina é ligada e é aplicada uma corrente 
continua. 
 
 
 
Como os aminoácidos diferentes 
possuem pI diferentes, um aminoácido cujo pI 
no caso da Alanina é igual a 6,02 esta próximo do pH do tampão que é 6, sendo assim a carga 
líquida desse aminoácido é 0 e como ele não possui carga líquida não vai sair da origem. O pI do 
Ácido Aspártico é 2,98, se o pH é 6, ou seja o pH da solução é maior do que o pI do aminoácido, e 
quando o pH é maior do que pI a molécula esta carregada negativamente, então o Ácido Aspártico 
vai migrar para pólo positivo, o anodo. No último caso você tem a Arginina que tem o pI=10,76 e 
como pH é 6, então o pH e menor do que o pI, nessa situação a carga líquida da Arginina é positiva 
e por tanto vai migrar para o pólo negativo o catodo. 
Isso ocorre com qualquer aminoácido e dependendo da diferença entre o pH e o pI eles vão 
migrar com diferentes velocidades, sendo assim então possível separar esse aminoácidos em 
diferentes frações. 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 25 - Eletroforese. 
Vivian Rocha 
 
33 
 
Cromatografia líquida de alta eficiência 
Nessa técnica dependendo do tipo matriz que é utilizada, podemos separar os aminoácidos 
tanto pelo principio de partição como pelo principio de troca iônica. Isso vai depender do tipo 
que matriz que esta presente na coluna. 
Esse método de cromatografia não cria nenhuma novidade em relação os princípios básicos 
que norteiam a separação dos aminoácidos. Na realidade esse método de cromatografia possui uma 
melhoria técnica que permite que processo seja feito de forma mais rápida e com maior eficiência. 
Esse método continua usando uma coluna igual à cromatografia de troca iônica normal, só 
que o liquido que vai promover a separação passa através de uma coluna sob alta pressão que é dada 
por uma bomba, de forma que o fluxo nesse equipamento ocorre muito mais rapidamente, e a 
separação que em uma cromatografia normal poderia durar até 24hrs nessa metodologia ocorre em 
até 30 min. 
Abaixo se encontra um esquema básico da técnica. O solvente é bombeado através de uma 
bomba de alta pressão até um filtro que retira partículas de grande tamanho, chega ate uma válvula 
de injeção onde a amostra é aplicada e esta é arrastada pelo fluxo de solvente passando por uma pré-
coluna para tirar partículas mais finas e então entra na coluna que pode ser preenchida com uma 
matriz que vai promover a separação por partição ou por troca iônica e então são eluídas da coluna 
de forma seletiva, separando os componentes da mistura em frações. Ao saírem da coluna esses 
aminoácidos serão detectados por um detector e o sinal desse detector é mandado para o 
computador que gera um cromatograma de eluição. 
 
Figura 26 - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. 
Na verdade essa metodologia requereu vários aprimoramentos técnicos para poder ser 
empregada. 
Utilizando esse sistema é possível identificar todos os 
aminoácidos comumente encontrados na estrutura da proteína, utilizado 
um único cromatograma. 
Na realidade grande parte dos aminoácidos não absorve luz no 
comprimento de onda, isso quer dizer que os aminoácidos não possuem 
cor. A exceção são três aminoácidos: Triptofano, Tirosina e a 
fenialanina. 
Esses três aminoácidos com poucos anéis aromáticos em suas 
cadeias laterais e que absorvem fortemente no caso do Triptofano e da 
Tirosina luz ultravioleta e no caso da Felialanina mais fracamente esta 
luz. Isso quer dizer que se fossemos insetos veríamos uma solução de 
Triptofano, Tirosina e Felialanina uma vez que os insetos conseguem 
enxergar luz ultravioleta nesse comprimento de onda. Entretanto nossos 
fotoreceptores não são excitados por esses comprimentos de onda. Então 
Figura 27 - Absorbância do 
Triptofano, Tirosina e da 
Fenialanina. 
Vivian Rocha 
 
34 
 
uma solução com esses três aminoácidos seria incolor, isso quer dizer que se vocês aplicassem uma 
mistura de aminoácidos em uma folha de papel, depois de uma cromatografia no final vamos ter 
uma folha de papel em branco. 
Então para detectar a posição do aminoácido depois da cromatografia em papel, e ter certeza 
que tudo saiu na cromatografia de troca iônica e na de eletroforese é preciso fazer uma reação 
química que ira modificar a estrutura no aminoácido e torná-lo em um composto colorido que pode 
ser identificado visualmente ou quantificado por um equipamento, como por exemplo, um 
espectrofotômetro. 
Reações Químicas para Revelação de Aminoácidos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Essas reações podem ser classificadas em que é o caso da reações de uso geral reação de 
 que detecta indistintamente qualquer
tipo de aminoácido uma vez que ela reage com ninidrina
aminas primárias ou secundárias que estão presentes em qualquer tipo de aminoácido e reações 
 que vão reagir com determinados grupamentos químicos presentes na cadeia lateral, específicas
como esses grupamentos químicos vão estar presentes em um ou poucos aminoácidos a produção de 
cor vai identificar necessariamente aquele aminoácido na mistura. 
Como a grande maioria dos aminoácidos que só possuem hidrocarbonetos na cadeia lateral 
não pode ser detectada, uma vez que não há reagentes que ataquem essas cadeias de 
hidrocarbonetos. 
O reagente de ninidrina que é um reagente que detecta indiscriminadamente qualquer tipo de 
aminoácido uma vez que a ninidrina reage com o grupamento alfa amino de todos os aminoácidos 
ou com o grupamento imino presente especificamente na Prolina, nesse caso a reação do 
grupamento com a amina primária vai produzir um composto de coloração púrpura que a reação 
com a amina secundária presente na Prolina vai produzir um composto com coloração amarela. 
Então a reação com ninidrina é uma reação específica apenas para a Prolina. 
Essa reação é a mesma utilizada para detectar impressões digitais em papel, pois o dedo 
secreta muito aminoácido. 
Os aminoácidos diferem em suas cadeias laterais, que apresentam 
propriedades características. Estas diferenças podem ser usadas para identificar e 
quantificar um aminoácido. 
Reação de ninidrina. Ao reagir com o grupamento amino dos 
aminoácidos produz um composto de coloração púrpura. A Prolina, por possuir 
um grupamento imino produz um composto de coloração amarela. 
Reação de Sakaguchi. Usada para a determinação da Arginina. O 
composto resultante da reação tem coloração vermelha. 
Reação de Pauly. O ácido sulfanílico diazotado (reagente de Pauly) reage 
com os grupamentos imidazol e fenol da Histidina e da Tirosina produzindo 
coloração que varia do laranja ao vermelho. 
Reagente de Ehrlich. O p-dimetilaminobenzaldeído (em ácido HCL 
concentrado) reage com o grupamento indol do Triptofano produzindo 
coloração violeta. 
Reação com Nitroprussiato de Sódio. Este composto reage com o 
Vivian Rocha 
 
35 
 
A é essa ao lado. A ninidrina reação da ninidrina
geralmente é dissolvida em acetona e em acetona a ninidrina existe 
em duas formas tautoméricas que estão ilustradas ao lado (a forma 
enol e a forma aceto). 
Como a grande maioria dos aminoácidos quando reage com 
ninidrina forma um composto único, motivo pelo qual não se pode 
utilizá-la antes que os aminoácidos sejam fracionados, pois a cadeia 
lateral é quem dá a diferença de polaridade e os grupamentos 
carboxílicos e aminos que geram diferenças de cargas são perdidos. 
Em alguns casos é desejável que você consiga modificar o 
aminoácido para detectá-lo à medida que o processo de separação 
vai ocorrendo, então nesses casos você não pode usar a ninidrina e 
usa um reagente alternativo que modifica o aminoácido, mas não 
altera de forma drástica suas propriedades. Isso economiza tempo e 
reagente. 
A técnica desse tipo é chamada de técnica pré-derivação, ou 
seja, uma modificação antes da técnica de fracionamento é a reação 
utilizando o glutaraldeído. Nessa técnica você reage o seu 
aminoácido com glutaraldeído acrescenta esse reagente aqui que é o 
β-mercaptoetanol e isso gera uma molécula derivada do aminoácido. 
Se você observar todos os aminoácidos vão ganhar uma porção comum, um anel duplo aqui 
derivado do o glutaraldeído ligado através do átomo de enxofre com a molécula de β-
mercaptoetanol. Esses aminoácidos mantêm intacta a sua cadeia lateral de forma que você vai pode 
fracionar aqueles aminoácidos baseados em diferença de coeficiente de partição e vai manter intacto 
também o grupamento alfa carboxílico e grupamento amino que agora é transformado em uma 
amina terciária, sendo assim você continua podendo utilizar a diferença de carga desses 
aminoácidos para promover sua separação. 
Qual é a vantagem disso? Se você realiza essa reação com a mistura de aminoácidos antes 
da técnica de fracionamento, ao invés de você realizar varias reações independentemente em cada 
fração eluida da coluna você precisa fazer a reação apenas uma vez, antes de aplicar a mistura na 
coluna. E você pode monitorar a saída dos aminoácidos em tempo real à medida que aqueles 
aminoácidos vão sendo fracionados, uma vez que essa molécula que foi adicionada na estrutura de 
todos os aminoácidos é uma molécula florescente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 28- Reação de Ninidrina. 
Vivian Rocha 
 
36 
 
Isso permitiu, por exemplo, a realização desse cromatograma abaixo. 
Então essa metodologia é interessante porque você pode 
identificar o aminoácido através do tempo de retenção. Então cada 
aminoácido vai demorar um determinado tempo para sair da 
coluna, sendo assim existem aminoácidos mais rápidos e que por 
tanto saem primeiro e outros aminoácidos mais lentos que saem 
por último. Então o que identifica o aminoácido nesse experimento 
é o tempo de retenção. E o que indica a quantidade com que aquele 
aminoácido esta presente na mistura é a florescência, que será 
diretamente proporcional à quantidade moléculas presentes na 
solução, quanto maior a quantidade de aminoácidos maior será a 
florescência, assim você pode fazer uma curva de calibração para 
correlacionar a intensidade da florescência do aminoácido com a 
quantidade daquele aminoácido presente na mistura. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 29 - Cromatograma - 
Efeito se Retenção. 
Vivian Rocha 
 
37 
 
AULA 4 - ESTRUTURA DE PROTEÍNAS 
Vimos ate agora a estrutura dos aminoácidos, a função deles, as propriedades que esses 
aminoácidos têm e algumas metodologias utilizadas para o fracionamento deles. A partir dessas 
informações vamos ver como estes aminoácidos estão inseridos na estrutura da proteína. 
Todo mundo sabe que cada ser vivo, seja ele unicelular ou multicelular contem milhares de 
tipos diferentes de proteínas, de uma maneira geral organismos têm um número mais reduzido de 
proteínas, um organismo procarionte contém cerca 2.400 proteínas diferentes, por outro lado 
organismos multicelulares possuem um número muito maior de proteínas, cerca de 30 mil ou mais 
proteínas diferentes. Cada uma dessas proteínas possui sua estrutura característica que é codificada 
pelo genoma e que é caracterizada por diferentes graus de estruturação. Então uma proteína sempre 
vai possuir uma estrutura primária que é constituída pelos aminoácidos que compõem a estrutura 
daquela proteína e que são colocados em uma ordem pré-definida que é dada pelo gen. 
Em relação à estrutura primária da proteína, uma pode ser diferenciada da outra através 
de três critérios: 
 O número de aminoácidos presente na cadeia polipeptídica - Existem proteínas pequenas 
como à insulina que possui menos de 100 aminoácidos e proteínas grandes como a 
ciclosporina ciclase que possui mais de 15 mil aminoácidos, entretanto o número de 
aminoácidos não é um critério confiável para se diferenciar uma proteína da outra, pois 
podem existir duas ou mais proteínas com o mesmo número de aminoácidos e que são 
diferentes. 
 Composição - Os tipos de aminoácido que estão presentes naquela cadeia polipeptídica e a 
quantidade relativa de cada um deles. Entretanto este critério também não é um critério 
confiável, pois podem existir duas ou mais proteínas com o mesmo número de 
aminoácidos, contendo exatamente os mesmos aminoácidos nas mesmas proporções e 
essas proteínas serem diferentes. 
 Através da ordem
na qual os aminoácidos se distribuem ao longo da cadeia polipeptídica - 
Esse é um critério confiável. 
 
Essa proteína tem os aminoácidos A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 e A8 se ela tivesse os 
mesmos aminoácidos na ordem invertida ela seria uma proteína completamente diferente apesar de 
possuir o mesmo número de aminoácidos e nas 
mesmas quantidades. 
 Essa proteína possui uma estrutura 
 que é aquela ligação dos aminoácidos primária
em uma determinada ordem formando a cadeia 
polipeptídica. Essa cadeia de aminoácidos vai se 
organizar espacialmente de acordo com as 
características locais em uma determinada conformação. E essa região local da cadeia polipeptídica 
devido a sua composição de aminoácidos adquire uma conformação tridimensional particular, essa 
conformação tridimensional particular que a cadeia polipeptídica vai adquirindo é chamada de 
estrutura secundária. 
Determinadas regiões da cadeia polipeptídica ou da estrutura primária de acordo com a 
composição dos aminoácidos, vão preferir adquirir uma conformação específica. 
Figura 30 - Estrutura Primária da Proteína. 
Vivian Rocha 
 
38 
 
Com isso teremos determinadas regiões que irão preferir formar, por exemplo, uma estrutura 
chamada de alfa hélice, outras s uma sequência aleatória, e uma terceira região que ira formar uma 
estrutura secundária que chamamos de fita beta e assim por diante. Então essas organizações 
estruturais locais na cadeia polipeptídica são chamadas de . estruturas secundárias
Em um terceiro grau de organização essas diferentes estruturas secundárias se organizam 
espacialmente formando uma estrutura tridimensional mais compacta. De uma maneira geral para 
muitas proteínas a é o grau final de organização que elas atingem. estrutura terciária
Existem outras proteínas que gostam de trabalhar associadas com uma ou mais subunidades 
que podem ser do mesmo tipo ou de tipos diferentes. Nesse caso essas interações que geralmente 
são interações não covalentes entre subunidades diferentes, o que faz com que aquela estrutura se 
torne estável o suficiente para ser isolada com unidade única. 
Um exemplo clássico de uma proteína com é a hemoglobina que é estrutura quaternária
uma proteína que possuem uma estrutura quaternária com 4 subunidades polipeptídicas diferentes. 
Essas subunidades são de dois tipos diferentes, duas dessas subunidades são iguais entre si por tanto 
são produzidas a partir da informação de um determinado gen, assim como as outras duas. 
A Formação da Cadeia Polipeptídica 
A estrutura primária é formada pela ligação covalente entre os diferentes aminoácidos e essa 
ligação ocorre em uma determinada proteína sempre na mesma ordem. 
A cadeia polipeptídica é uma estrutura polarizada, ou seja, ela tem uma extremidade com 
um grupamento alfa amino livre que chamamos de n-terminal e uma extremidade com grupamento 
alfa carboxílico livre que é chamada de extremidade c-terminal. 
A cadeia polipeptídica contém duas 
extremidades distintas, a extremidade n-terminal que 
contem um grupamento alfa amino livre e uma 
extremidade chamada de c-terminal que contém um 
grupamento alfa carboxílico livre, essas duas 
extremidades não estão que não envolvidas em 
nenhuma ligação peptídica. Todos os outros 
grupamentos alfa amino e alfa carboxílico vão estar envolvidos em ou ligações ligações peptídicas
amida que mantêm esses aminoácidos unidos uns aos outros. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 31- Cadeia Polipeptídica. 
Vivian Rocha 
 
39 
 
As Ligações Peptídicas Ocorrem em Trans ou em Cis 
Essas ligações peptídicas podem ocorrer em duas configurações distintas. 
 Os dois aminoácidos que participam da ligação peptídica estão dispostos em relação a 
essa ligação de forma de oposta, essa organização é chamada de Trans. 
 
Figura 32 - Configuração Trans. 
 Os dois aminoácidos que participam da ligação peptídica podem estar dispostos do 
mesmo lado em relação a essa ligação, essa organização é chamada de Cis. 
 
Figura 33 - Configuração Cis. 
A configuração Trans é mais comum, devido ao fato de dois resíduos de aminoácidos 
estarem em lados opostos da ligação peptídica, havendo assim pouco impedimento estérico, pouca 
sobreposição de átomos presentes em resíduos vizinhos, ao passo que no tipo de configuração Cis o 
fato dos dois resíduos estarem posicionados no mesmo lado da ligação há a possibilidade de haver 
sobre posição de átomos tendo então impedimento estérico o que torna essa configuração 
desfavorável. 
Entretanto raramente encontramos ligações peptídicas em configuração Cis em cadeias 
polipeptídicas, geralmente quando esta é encontrada existe a participação de pelo menos um resíduo 
de Prolina naquela ligação, visto que este aminoácido geralmente esta preso no grupamento do 
nitrogênio evitando que essa cadeia lateral se sobreponha com a cadeia lateral de outro aminoácido. 
 Cada um desses aminoácidos que esta envolvido na formação da cadeia polipeptídica Obs.:
é chamado de resíduo. 
Geometria da Ligação Peptídica 
A ligação peptídica obteve sua geometria determinada por dois 
químicos americanos, Linus Pauling e Robert Corey que determinaram 
as distâncias entre os átomos envolvidos na ligação peptídica e os 
ângulos das ligações dos componentes desta. 
Eles observaram que a distância entre o átomo de carbono e o 
átomo de nitrogênio (ligação peptídica), era mais curta do que uma 
ligação de carbono e nitrogênio normal. Eles atribuíram essa menor 
distância entre os átomos de carbono e nitrogênio na ligação peptídica Figura 34 - Geometria da Ligação 
Peptídica em Trans. 
Vivian Rocha 
 
40 
 
ao fato dessa ligação ter característica de , esse fenômeno foi explicado através do dupla ligação
 que ocorre com a dupla ligação da ligação carbono-nitrogênio se fenômeno de ressonância
deslocando por essa ligação. 
A Ligação Peptídica Apresenta Característica de Dupla Ligação 
Aqui você tem uma cadeia polipeptídica onde à ligação amida representada com uma 
estrutura de ressonância. 
 
 Figura 35 - Fenômeno de Ressonância. 
 
Nesse caso, você tem a ligação peptídica com característica de dupla ligação. 
Essa característica de dupla ligação promovida pela ressonância dos elétrons entre a 
carbonila e a ligação carbono-nitrogênio provoca duas consequências importantes: 
 O impedimento da livre rotação do carbono e do nitrogênio ao redor do eixo de ligação. 
Dessa forma o número de conformações que a cadeia polipeptídica pode adquirir é 
limitado. 
 O oxigênio e o nitrogênio ganham cargas parciais, negativa e positiva respectivamente. O 
fato de o oxigênio ter carga parcial negativa e o nitrogênio carga parcial positiva permite 
que eles formem pontes de hidrogênio, importantes para estabilizar algumas das 
estruturas secundárias que ocorrem nas proteínas. 
Torções são possíveis ao redor da ligação Phi (φ) e Psi (ψ) 
O ângulo de torção entre o carbono alfa e o carbono da carbonila é chamado ângulo de 
torção psi (ψ) e o ângulo de torção entre o carbono e o nitrogênio é chamado de ângulo de torção 
phi (φ). 
A conformação que a cadeia polipeptídica adquire no espaço é dada pela combinação de 
ângulo phi (φ) e psi (ψ) de cada resíduo de aminoácidos presentes na cadeia polipeptídica. 
 
Figura 36 - Ângulos Phi(φ) e Psi (ψ). 
O ângulo de torção phi (φ) ocorre no sentido horário e o ângulo de torção psi (ψ) ocorre no 
sentido anti-horário. 
O fato de termos característica de dupla ligação entre o C e o N da ligação peptídica 
restringe a quantidade de conformações que a cadeia polipeptídica pode adquirir no espaço. 
As conformações possíveis são dadas exclusivamente pelo giro ao redor da ligação do
carbono alfa-nitrogênio e carbono alfa-carbono da carbonil, mas mesmo estes giros não são 
irrestritos, alguns ângulos de giros são permitidos e outras combinações de ângulos de giros são 
restringidos, devido ao fato de haver impedimento estérico. 
Vivian Rocha 
 
41 
 
Abaixo temos três situações onde às combinações de ângulo phi (φ) e ângulo psi (ψ) 
colocam em proximidade átomos de um plano da ligação peptídica em relação à ligação peptídica 
vizinha. Nessa combinação de ângulos como átomos de planos de ligações peptídicas vizinhas estão 
sobrepostos obviamente essas combinações de ângulos não ocorrem na natureza. 
Essa outra combinação 
de ângulo é permissível, por que 
o ângulo de torção phi (φ) e psi 
(ψ) é de tal forma que os 
componentes desse plano da 
ligação peptídica estão distantes 
do plano da ligação peptídica 
vizinha e nessa combinação de 
ângulos não tendo nenhum 
impedimento estérico que torne 
instável aquela conformação. 
Plot Ramachandran 
Um cientista indiano pegou cerca de 24 estruturas de proteínas que tinham sua conformação 
tridimensional determinada e calculou os ângulos phi (φ) e psi (ψ) de cada um dos aminoácidos que 
constituíam aquelas proteínas e plotôu a torção ao redor phi (φ) contra a torção ao redor da ligação 
psi (ψ) de cada um dos átomos no plano cartesiano e observou esse conjunto de dados abaixo. 
No eixo do X você tem o ângulo de torção ao redor da 
ligação phi (φ) que é do carbono alfa e nitrogênio variando de 0 
a -180 e de 0 a 180. No eixo Y você tem o ângulo de torção ao 
redor do eixo de ligação psi (ψ) que vai de 0 a 180 e de 0 a -180. 
Os pontos do par ordenado ângulo de torção phi (φ) e 
ângulo de torção psi (ψ) estavam agrupados em dois quadrantes 
do gráfico. No quarto quadrante praticamente não havia 
observações experimentais e no segundo quadrante o número de 
observações experimentais era bem reduzido. Por que você não 
tem nas proteínas essas combinações de ângulos (quadrante 4) e 
essa combinações de ângulos (quadrante 2) são bem raras? Pois 
são aquelas combinações de ângulos que levam planos de 
ligações peptídicas vizinhas se sobreporem uns aos outros. Por 
outro lado às combinações de ângulos estáveis são bem raras e 
invariavelmente essas combinações de ângulos que são 
permitidas por não provocarem impedimento estérico levam a 
formação de estruturas secundárias bem estabelecidas. Então 
essas combinações de ângulos phi (φ) e psi (ψ) localizadas no 
quadrante 3 levam a formação, por exemplo, de uma estrutura 
secundária chamada de alfa hélice, ao passo que essas combinações de ângulos do primeiro 
quadrante levam a formação de outro tipo de estrutura secundária que são as fitas betas 
antiparalela e paralela e nesse caso especifico a hélice tripla do colágeno. 
Figura 37 - Combinações de ângulo phi (φ) e psi (ψ) . 
Figura 38 - Plot Ramachandran. 
Vivian Rocha 
 
42 
 
A restrição imposta quanto ao número de conformações que a cadeia polipeptídica pode 
assumir no espaço é tão grande que a pouca liberdade conformacional que resta leva aquela cadeia 
polipeptídica a adquirir conformações locais bem definidas que são a alfa hélice é a fita Beta. 
Vamos começar a falar dessas duas estruturas secundárias. 
Em relação aos ângulos de torção phi (φ) e psi (ψ), ao redor desses ângulos de rotação 
podemos girar tanto para um lado como para outro. Na realidade o sentido da rotação é o que vai 
dizer se o ângulo é positivo ou negativo. No caso especifico do ângulo de torção phi (φ) apesar da 
ligação poder girar no sentido horário ou no sentido contrário, convencionou-se a assumir que os 
ângulos de torção phi (φ)que giram no sentido horário têm medida de ângulo positiva, então ele 
varia de 0 a 180 e no caso dele girar anti-horário ele tem um ângulo de torção negativa variando de 
0 a -180. Semelhantemente o ângulo de torção psi (ψ) (que é ângulo entre o carbono alfa e o 
carbono da carbonila) que pode girar tanto para direita no sentido horário quanto no sentido anti-
horário, mais convencionou-se que o giro no sentido anti-horário tem medida de ângulo negativo e 
varia de 0 a -180 e o giro no sentido horário tem medida de ângulo positivo e varia de 0 a 180. 
Então na verdade a torção pode ocorrer para qualquer lado, o que se convenciona é para que lado a 
torção é positiva e para qual lado a torção é negativa. 
Alfa Hélice 
A estrutura da alfa hélice foi determinada 
cristalograficamente por aqueles dois cientistas 
americanos. Ela recebeu esse nome de alfa 
hélice por dois 
motivos: Ela lembra a 
estrutura a estrutura de 
uma hélice e ela foi à 
primeira estrutura 
secundária que teve sua 
geometria definida, por isso 
recebeu o nome de alfa. A fita 
beta foi à segunda estrutura 
secundária que teve sua 
geometria determinada cristalograficamente e 
por ser a segunda recebeu o nome de beta. No 
caso da alfa ela tem uma forma de hélice e no 
caso da beta ela possui forma de uma fita. 
 Na figura cada resíduo de aminoácido 
pode ser identificado por um bastão cinza que se projeta para fora da 
hélice, este bastão representa a cadeia lateral do aminoácido. 
Outra coisa interessante na alfa hélice é que devido a essa estrutura regular os grupamentos 
estão sempre posicionados de forma distinta. Então todos os oxigênios de todas as carbonilas 
apontam sempre no mesmo sentido, para cima. Os oxigênios dos grupamentos amino também 
apontam sempre para o mesmo sentido que é para baixo. O grupamento carbonila do primeiro 
aminoácido da alfa hélice fica posicionado exatamente abaixo do grupamento amino do quinto 
Figura 39 - Estrutura 
de Alfa Hélice. 
Vivian Rocha 
 
43 
 
Cada grupamento C=O e N-H da 
cadeia principal forma ponte de 
hidrogênio com a ligação 
peptídica do quarto resíduo à 
frente, por exemplo, O (i) com 
N(i+4). Isto permite a formação 
aminoácido. A carbonila do grupamento carboxila do segundo aminoácido fica posicionada 
exatamente abaixo do nitrogênio do grupamento alfa amino do quinto aminoácido. 
O oxigênio tem carga parcial negativa e o nitrogênio tem carga parcial positiva que pode 
passar para o hidrogênio, como o nitrogênio esta no prejuízo 
ele é mais eletronegativo e puxa a nuvens de elétrons para o 
lado dele e deixa o hidrogênio parcialmente positivo. Então 
você tem uma carga parcial positiva no oxigênio e uma carga 
parcial positiva no 
hidrogênio, isso 
faz com que o 
oxigênio forme 
uma ponte de 
hidrogênio com o hidrogênio. Isso quer dizer que na 
estrutura alfa hélice essa conformação geométrica bem 
definida é estabilizada por interações do tipo ponte de 
hidrogênio que é formada entre oxigênio da carbonila 
com grupamento amino do quarto grupamento aminoácido a frente dele, esse tipo de 
estabilização faz com que a alfa hélice seja uma das estruturas secundárias mais estáveis encontrada 
nas proteínas. Outra coisa interessante é que as cadeias laterais dessa alfa hélice estão todas 
apontando para fora e todas no mesmo sentido. 
Fita Beta 
Essa é a segunda estrutura secundária que tem a geometria bem definida. Ao contrario da 
estrutura da alfa hélice que possui uma estrutura compacta é a estrutura da fita beta é 
bem distendida, coerentemente com essa visão que vocês têm a distância entre dois 
resíduos de aminoácidos vizinhos é de 3,5 Å, ao contrario da alfa hélice onde distância 
de dois resíduos vizinhos é de 1,5 Å. Então a estrutura da fita beta e mais de duas 
vezes estendida do que a da alfa hélice. 
O característico nessa fita beta, é o traçado da cadeia polipeptídica ao em vez 
de ser enovelado ao redor de um eixo principal, corre livre no espaço formando um 
ziguezague, então
a cadeia hora vai para a direita, ai muda de direção ou de sentido. 
O sentido em que os grupamentos dos aminoácidos vão estar orientados. 
Novamente o bastão cinza representa a cadeia lateral. Os grupamentos de aminoácidos 
vizinhos possuem orientações opostas, grupamentos iguais de aminoácidos adjacentes 
têm orientações opostas. 
Essa fita possui uma orientação alternada do grupamento alfa amino e alfa 
carboxílico, o grupamento amino apontando para baixo, depois para cima, depois para 
baixo novamente (sucessivamente). O oposto acontece com grupamento 
carboxílico o oxigênio que esta apontando para cima, depois para baixo e 
Figura 40 - Estrutura de 
Fita Beta. 
Todos os grupamentos C=O apontam no mesmo sentido. Todos os 
grupamentos N-H apontam no sentido oposto. Os grupamentos laterais 
apontam para fora do eixo da hélice e geralmente são orientados para a região 
N-terminal. 
 
Vivian Rocha 
 
44 
 
novamente para cima (sucessivamente). Essa orientação alternada permite que uma cadeia (fita 
beta) interaja com a cadeia vizinha (fita beta) através de pontes de hidrogênio. Essa interação se da 
pelo oxigênio interagindo com o oxigênio e o oxigênio interagindo com hidrogênio. 
Essa fita beta pode ocorrer sozinha na estrutura da proteína, mas geralmente ela vai interagir 
com duas ou mais fitas betas formando uma estrutura supra secundária chamada de folha beta. A 
folha beta pode apresentar três tipos de organização distintos: 
 : As fitas betas correm no sentido n-terminal para o c-terminal, Folha Beta Antiparalela
indicado pela seta. A segunda fita esta disposta de forma antiparalela em relação à 
primeira, correndo no sentido oposto. 
 : Essa folha beta é composta por 4 fitas betas que tem orientação Folha Beta Paralela
paralela, todas correm no mesmo sentido, uma paralela a outra. 
 : Essa fita não pode ser classificada nem como paralela e nem como Folha Beta Mista
antiparalela. A primeira em relação à segunda é antiparalela que paralela em relação à 
próxima. 
 
 
Figura 41 - Folhas Betas. 
 
Duas fitas betas antiparalelas são conectadas por uma estrutura que é chamada de grampo
ou . Usualmente essa volta beta contem um número bastante reduzido de aminoácidos volta beta
comumente você encontra uma volta beta com 1, 2, 3 ou 4 resíduos de aminoácidos, mais você pode 
ter voltas com número maior só que essas voltas com um número maior de aminoácidos são menos 
frequentes. 
As proteínas geralmente são constituídas de vários tipos de estruturas secundárias duas das 
mais bem caracterizadas são a alfa hélice que são representadas nos desenhos a seguir por molinhas 
verdes e as fitas betas que estão representadas nos desenhos por setas vermelhas. Essas duas 
estruturas não são as únicas estruturas secundárias que existem, entretanto as outras estruturas 
secundárias não são detalhas nos livros textos por que não existe uma geometria comum bem 
definida que caracterize essas estruturas. Essas estruturas que não possuem geometria bem definida 
são chamadas de ou regiões de sequência aleatória região de estrutura 
. Entretanto elas só são aleatórias se as compararmos com a aleatória
estrutura aleatória de outra proteína, agora se compararmos com moléculas 
da mesma proteína a geometria é exatamente igual. 
As folhas betas dispostas de forma antiparalela são unidas através de 
uma volta beta ou um grampo e geralmente essa volta beta ou grampo que 
são formados por poucos aminoácidos. A forma como as folhas betas 
Figura 42 - Beta-Alfa-
Beta. 
Vivian Rocha 
 
45 
 
paralelas são unidas é diferente, por que para formar uma folha beta antiparalela a fita beta corre em 
um sentido e você precisa apenas inverter o sentido da fita em um ângulo de 180º graus para fazer 
com que dois segmentos de fita beta se disponham de forma antiparalela e essa mudança de 
orientação no ângulo de 180º graus pode ser feita simplesmente por uma dobra e a volta beta. 
Entretanto temos as folhas betas paralelas formadas por 
segmentos de uma mesma cadeia polipeptídica onde 
precisamos girar a orientação da cadeia em 360º graus. 
Em um motivo beta-alfa-beta duas fitas paralelas 
formam uma folha beta conectadas por uma alfa hélice, 
como ilustra a figura 42. Geralmente é um motivo mais 
frequente quando você encontra proteínas contendo 
folhas betas paralelas. 
Ao lado temos três proteínas diferentes que se 
caracterizam estruturalmente por serem formadas: predominantemente de alfa hélice que são 
chamadas de ou predominantemente por toda alfa (A)
fitas betas, então o motivo estrutural dessa proteína é 
 ou ainda uma proteína que é formada por quantidades quase que equivalentes de alfa toda beta (C)
hélice e fita beta (B), sendo uma proteína de estrutura ou mista alfa- . beta
Essas fitas betas que estão representadas nessa estrutura estão dispostas uma em relação à 
outra de forma antiparalela, como tal uma fita beta é unida a outra pela voltas betas que geralmente 
são estruturas curtas que conectam duas regiões de fita beta formando uma folha beta antiparalela. 
No caso B esse feixe de fitas betas está disposto de forma paralela. Uma fita beta é conectada a 
outra através de um motivo do tipo: alça, uma alfa hélice e outra alça, ou seja, elas se conectam 
através daquele motivo beta-alfa-beta. 
Nos livros textos as únicas estruturas secundárias que tem sua geometria descrita são a alfa 
hélice e a fita beta, entretanto existem mais proteínas 
com outros tipos de estruturas secundárias, mais elas 
não são descritas pelo fato delas não possuírem uma 
geometria que possa universalmente descrever todas 
essas estruturas. 
Na realidade todas as proteínas são formadas a 
partir da sua estrutura primária, que de acordo com a 
característica local dos aminoácidos faz com que a 
cadeia polipeptídica adquira uma determinada 
conformação que é chamada de estrutura secundária e 
as diferentes estruturas secundárias se organizam espacialmente formando uma estrutura mais 
compacta que é a estrutura terciária. 
Como as diferentes estruturas secundárias formadas pelo enovelamento local dos 
aminoácidos interagem umas com as outras para montagem da estrutura terciária? As diferentes 
estruturas secundárias que são caracterizadas por essas molinhas que são as regiões de alfa hélice, 
por essas regiões representadas por setas que são as fitas betas e por essas regiões formadas por 
filamentos que são as alças ou regiões de sequência de estrutura randômica. Cada proteína tem uma 
estrutura primária distinta que confere determinados tipos de estruturas secundárias que vão se 
organizar sempre da mesma forma. 
Figura 43 - Interação de fitas Alfas Hélice com 
Fitas Beta. 
Figura 44 - Diferentes estruturas secundárias. 
Vivian Rocha 
 
46 
 
As interações entre as diferentes estruturas secundárias ocorrem principalmente através de 
interações hidrofóbicas. 
Na figura abaixo temos a representação da cadeia polipeptídica com a cadeia lateral dos 
aminoácidos sendo representados por esses pingos verdes e azuis. As estruturas representadas em 
azul são as cadeias laterais dos aminoácidos que tem 
característica polar, enquanto que as estruturas 
verdes representam as cadeias laterais que tem 
característica apolar. Essa estrutura ao adquirir sua 
conformação secundária, tende a se organizar de tal 
forma que as cadeias laterais dos aminoácidos com 
característica hidrofílica fiquem voltadas para fora 
em contato com o ambiente aquoso da célula, 
enquanto que as cadeias laterais hidrofóbicas tendem 
a se refugiar no interior da estrutura proteica onde 
eles interagem uns com os outros e fogem do contato com o ambiente aquoso da célula. Um 
exemplo disso
é a mioglobina isolada do músculo (figura abaixo) de uma baleia cachalote, essa 
proteína que nos também possuímos, serve para armazenar oxigênio. Como temos pouca 
mioglobina no músculo não conseguimos ficar muito tempo sem ar, já á baleia consegue mergulhar 
por cerca 20 ou 30 min. e essa capacidade que ela possui é devido à presença de grande quantidade 
dessa proteína nos músculo o que faz com que ela armazene oxigênio e vá liberando lentamente à 
medida que ela necessite. 
Nessa primeira estrutura você tem a representação 
esquemática das diferentes estruturas secundárias, ela 
formada predominantemente por alfa hélice e varias alças 
que conectam essas hélices. Na segunda representação (d) 
abaixo você tem além das estruturas secundárias, a cadeia 
lateral dos aminoácidos que esta em azul, mais apenas 
aquelas que possuem característica hidrofóbica, muitas 
dessas cadeias presentes em estruturas secundárias 
vizinhas interagem umas com as outras e essa interação é 
o que vai manter as diferentes estruturas secundárias numa mesma posição. 
Na terceira representação a maioria dos resíduos hidrofóbicos que estão visíveis nessa figura 
não está presente na superfície dessa proteína, o que quer dizer que esses aminoácidos têm 
característica polar e os poucos resíduos com características apolares cujas cadeias laterais são 
visíveis ou são perceptíveis pela proteína ficam geralmente localizadas dentro de depressões que 
servem para mediar o contato especifico entre 
proteínas diferentes. 
Resumidamente você tem que as interações 
entre as diferentes estruturas secundárias de uma 
dada proteína são estabilizadas principalmente por 
interações hidrofóbicas que são interações do tipo 
, entretanto além dessas interações Van der Walls
que são as principais forças que mantêm a estrutura 
Figura 45 - Cadeia polipeptídica - Característica 
hidrofílica. 
Figura 46 - Mioglobina de uma Baleia 
Caxalote. 
Figura 47 - Interações do tipo ligação iônica, 
Van der Walls e Pontes de Hidrogênio. 
Vivian Rocha 
 
47 
 
tridimensional da proteína, você também pode ter a estrutura tridimensional da proteína sendo 
estabilizada por que são ligações entre O e H, entre um doador e um aceptor, pontes de hidrogênio
ou seja, um átomo com carga parcial negativa e outro átomo com carga parcial positiva. Ou você 
pode ter essas interações entre estruturas secundárias também estabilizadas por , ligações iônicas
que são ligações entre cargas positivas e negativas. Então essas três ligações não covalentes são 
responsáveis pela estabilização da estrutura terciária da proteína, as interações de Van der Walls 
sendo a força principal e as pontes de hidrogênio e as ligações iônicas servindo como forças 
auxiliares para a manutenção daquela estrutura tridimensional. 
Para a maioria das proteínas essas ligações não covalentes são suficientes para manter a 
integridade da estrutura tridimensional da proteína. De maneira geral todas as proteínas 
intracelulares são estabilizadas apenas por essas ligações não 
covalentes, mas muitas proteínas que são sintetizadas no 
interior da célula e são lançadas para fora da célula ou para um 
compartimento celular onde a variação das condições dentro 
daquele compartimento são equilibradas. Em situações onde as 
proteínas passam por variações das condições do meio, essas 
interações não covalentes são insuficientes para manter a 
integridade estrutural da proteína, nesses casos outra forma de 
aumentar a estabilidade dessas estruturas é através da formação 
 que ocorrem entre cadeias laterais de pontes de sulfeto
Cisteínas posicionadas próximas umas as outras. 
Quando o pH é diminuído ou a temperatura é aumentada as ligações não covalentes são 
quebradas, então uma proteína com estrutura terciária que é somente estabilizadas por essas 
ligações é facilmente desfeita nessas circunstâncias. Se houver um reforço de pontes de hidrogênio 
o efeito do pH e da temperatura continua ocorrendo, mas é incapaz de abrir completamente a 
estrutura da proteína, porque a mesma esta presa em vários pontos. Isso ocorre geralmente com 
proteínas que são secretadas para o exterior. O quarto tipo de ligação que é a ponte de sulfeto é uma 
ligação covalente que ajuda a estabilizar mais ainda a estrutura de proteínas. 
Para muitas proteínas a estrutura terciária é a forma como a mesma desenvolve a sua 
atividade biológica, entretanto outro conjunto de proteínas prefere trabalhar associadas com outra 
cadeia polipeptídica ou mais de uma cadeia polipeptídica que pode ser do mesmo que tipo que ela 
ou de tipo distinto formando um agrupamento proteico estável que pode ser fracionado e 
caracterizado. 
Antes de ser uma estrutura rígida a estrutura de uma proteína é uma estrutura dinâmica e 
esse dinamismo da estrutura proteica é que será responsável pela sua propriedade biológica uma vez 
que após a proteína interagir com sua molécula alvo ela muda de conformação para interagir melhor 
com o substrato e essa alteração de conformação só é possível devido a essa flexibilidade implícita 
da estrutura proteica. 
 
 
 
 
Figura 48 - Pontes de Sulfeto. 
Vivian Rocha 
 
48 
 
AULA 5 - MÉTODOS PARA PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS 
Nessa tabela estão expressas diversas proteínas, onde esta sendo enfatizada a diferença de 
tamanho da estrutura primária. Tais proteínas diferem entre si pelo número aminoácidos que 
compõem a cadeia polipeptídica, sendo este 
proporcional ao tamanho da proteína. Com isso 
uma proteína com poucos aminoácidos 
apresentará uma massa molecular pequena, 
assim como seu tamanho e uma proteína com um 
número grande de aminoácidos apresenta massa 
molecular grande, bem como seu tamanho. 
Nessa tabela é possível visualizar que as 
proteínas variam de tamanho e este vai estar 
ligado à massa molecular que por sua vez é 
relacionado com número de aminoácidos que a 
cadeia polipeptídica possui. A 
Além do tamanho ou do volume outra diferença é atividade biológica da proteína. 
Proteínas que possuem um pI menor que o pH vão ser negativas e são chamadas de 
, quando o pI for maior que o pH elas vão ser positivas e são chamadas de proteínas ácidas
. Cada proteína possui um pI característico dado pela composição de seus proteínas básicas
aminoácidos. 
As diferenças de características das proteínas (como tamanho, ponto isoelétrico e atividade 
biológica) podem ser usadas para promover a purificação de uma proteína de interesse a partir de 
uma mistura complexa. 
Abaixo esta ilustrada uma tabela de purificação, na qual existe um extrato bruto celular que 
contem milhares de proteínas, de uma célula, a qual apresenta uma proteína de interesse. Sendo esta 
submetida a varias etapas sequenciais de fracionamento, cada uma destas utilizando um principio de 
separação distinto, com isso diferentes frações são obtidas. À medida essas frações são obtidas é 
possível observar que o teor de proteínas vai diminuindo e as atividades específicas vão 
aumentando. 
Tabela 6- Purificação de uma enzima hipotética. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabela 5- Composição de algumas proteínas. 
Vivian Rocha 
 
49 
 
Salting in x Salting out 
No gráfico da pág 49 esta representada uma mistura com 5 proteínas diferentes: 
fibrinogênio, hemoglobina, pseudoglobulina, albumina sérica C e a mioglobina, onde é possível 
observar a solubilidade de cada uma dessas em função da força iônica do meio. 
Essa força iônica é diretamente proporcional à concentração de sal então quanto maior a 
concentração de sal no meio maior a força iônica e no caso das proteínas esse aumento da 
concentração de sal geralmente leva a diminuição da 
solubilidade, ocasionando o fenômeno
de salting out. 
Para todas essas proteínas é possível observar que à 
medida que a concentração de sal é aumentada a 
solubilidade diminui, essa diferença de solubilidade é 
específica para cada proteína. 
Em concentrações de sal que são suficientes para 
insolubilizar quase todo fibrinogênio as outras 4 proteínas 
permanecem solúveis, em uma concentração de sal 
suficiente para precipitar fibrinogênio, pseudoglobulina, 
hemoglobina e albumina sérica e a mioglobina permanecem 
solúveis. 
Em relação à concentração do meio a proteína apresenta dois fenômenos: O primeiro 
fenômeno é o de salting in que é o aumento da solubilidade da proteína com o aumento da 
concentração de sal. Visto que em baixas concentrações de 
sal as proteínas estão livres para interagir umas com as 
outras, se na superfície da proteína tem cargas negativas e 
positivas, essas cargas ao interagirem com proteínas vizinhas 
podem formar agregados proteicos muito grandes unidos 
através de interações eletrostáticas, esses agregados 
significam que a proteína não esta se solubilizando então a 
medida da solubilidade da proteína diminui. Quando é 
adicionado sal este se dissocia gerando íons positivos e 
negativos que interagem com as cargas positivas e negativas da superfície da proteína neutralizando 
aquelas cargas fazendo com que as ligações entre as proteínas elas se desfaçam. Os íons do sal 
neutralizam a carga na superfície da proteína evitando que estas se agreguem e melhorando a 
solubilidade da proteína. Tendo assim no fenômeno de salting in, quando a concentração de sal é 
aumentada ainda mais, o sal começa a roubar a água que estava interagindo com as proteínas e 
camada de solvatação da proteína é desfeita, com a retirada dessa camada de solvatação que 
impedia as interações entre os resíduos hidrofóbicos, as regiões hidrofóbicas de proteínas vizinhas 
começam a interagir e nessas condições você tem a formação de agregados proteicos, não mais 
através de interações iônica, mais através de interações hidrofóbicas. Então as proteínas que são 
mais suscetíveis ao fenômeno de salting out são aquelas que apresentam uma quantidade maior de 
machas hidrofóbicas na sua superfície enquanto que aquelas proteínas que não apresentam esses 
resíduos hidrofílicos praticamente não precipitam independemente da concentração de sal que você 
consiga adicionar a sua solução. 
 
Gráfico 3- Solubilidade de algumas 
proteínas em função da força iônica. 
Gráfico 4- Salting in x Salting out. 
Vivian Rocha 
 
50 
 
Técnicas de fracionamento em proteínas 
O primeiro grupo de metodologias que iremos estudar são coletivamente conhecidas como 
cromatografias líquidas. 
Cromatografias Líquidas 
 Cromatografia de exclusão em gel ou gel filtração 
 Cromatografia de troca iônica 
 Cromatografia de afinidade 
Essas cromatografias são feitas em colunas cilíndricas preenchidas com leito cromatográfico 
que é formado por esferas microscópicas que são formadas de polímeros naturais como polímeros 
de glicose dextranas e de agarose ou então polímeros sintéticos como polímeros de poliacrilamida. 
Dependendo da característica dessas esferas que são colocadas no interior do leito 
cromatográfico esse fracionamento pode ocorrer por diferença de tamanho, por diferença de carga 
ou por diferenças de atividade biológica da proteína. 
A cromatografia de troca iônica explora a diferença de carga, a cromatografia de exclusão 
em gel ou gel filtração explora a diferença de tamanho e a cromatografia de afinidade explora as 
diferentes atividades biológicas da proteína. 
Cromatografia de Exclusão em Gel ou Cromatografia de Gel Filtração 
Consiste em um liquido cromatográfico formado por milhões de esferinhas poliméricas que 
possuem uma porosidade cujo diâmetro do poro é regulado, esses poros permitem a passagem de 
moléculas de um determinado volume e exclui a entrada nesses poros de partículas de diâmetro 
superior ao do poro. Esses poros possuem diâmetros variados permitem o fracionamento de 
moléculas de vários tamanhos. 
As partículas menores ficam retidas no interior da esfera e as partículas maiores que só 
podem passar por entre as esferas saindo mais rápido. Então primeiro são eluídas as moléculas 
maiores (que foram excluídas do leito cromatográfico) e percorrem um caminho menor e depois as 
partículas de diâmetro menor que vão percorrer um caminho maior por dentro dos poros das esferas. 
Nessa cromatografia nos temos dois conceitos: o volume no qual foram eluídas as partículas 
que são excluídas do gel é chamado de volume de exclusão (V0) e volume de solvente que sai cada 
uma das moléculas após o volume de exclusão é chamado de volume de eluição (Ve). 
Existe uma relação entre a razão Ve/V0 e a massa molecular da proteína. E essa relação pode 
ser deduzida matematicamente se você conseguir fazer uma regressão para traçar a melhor curva 
que passa por esses pontos. Essa relação matemática entre a razão Ve/ V0 e a massa molecular da 
proteína fornecem um modo de determinarmos a massa molecular de uma proteína da qual não é 
conhecida esse parâmetro. 
Para determinar a massa molecular de uma proteína desconhecida, pegamos uma coluna de 
gel exclusão e escolhemos 4 ou 5 proteínas diferentes que a massa molecular seja conhecida e 
passamos essas proteínas através da coluna. Depois medimos o volume de exclusão da coluna e o 
volume de eluição de cada uma das suas proteínas que estamos usando como padrão e traçamos a 
razão Ve/V0 de cada proteína contra sua massa molecular, traçando a melhor curva que passa por 
essas 4 ou 5 proteínas achando assim uma curva padrão. nessa mesma coluna aplicamos a proteína 
Vivian Rocha 
 
51 
 
de massa desconhecida e determinamos o Ve/ V0 dessa proteína, projetamos isso na curva e a partir 
dessa curva vamos para eixo do x descobrindo assim a massa molecular da proteína. 
Como essa metodologia é feita sob 
condições que mantém as interações entre as 
diferentes partes das proteínas a massa 
molecular que estamos determinando por essa 
metodologia é a massa na estrutura nativa, ou 
seja, se a proteína possui uma estrutura 
terciária a massa molecular que você esta 
determinando é da estrutura terciária, se ela 
tem uma estrutura quaternária à massa 
molecular que você determina é a massa da 
estrutura quaternária, ou seja, a massa do 
conjunto das subunidades que se associam de 
forma estável. 
No gráfico é possível visualizar grande parte das moléculas está localizada exatamente sob a 
curva, mas algumas proteínas (em vermelho) estão um pouco distantes daquela curva, ou seja, elas 
são proteínas que fogem a regra geral, o que tem de característico em relação a essas proteínas que 
não estão diretamente sob a curva e que ao em vez delas serem proteínas perfeitamente esféricas, 
elas são proteínas geralmente com uma estrutura mais alongada. De uma maneira geral para essas 
proteínas se acomodarem exatamente sob a curva, 
elas precisam ter uma estrutura globular. Proteínas 
filamentosas ou mais alongadas fogem um pouco 
dessa regra geral. 
Ao lado se encontra um experimento real 
onde o individuo estava tentando purificar uma 
enzima obtida a partir de granulócitos humanos. O 
indivíduo fez um extrato dos granulócitos humanos, 
passou a mistura de proteínas pela coluna gel 
filtração. Esse extrato proteico foi separado em 5 
frações (pool do gráfico) distintas que ele observou na eluição na coluna de gel filtração. 
Determinando a atividade da enzima em cada uma dessas frações ele observou que a atividade de 
interesse foi eluída na região pool a e b. Ele uniu essas frações e utilizou essas frações para etapa 
seguinte de purificação. 
Cromatografia de Troca
Iônica 
A segunda cromatografia que podemos usar para separar proteínas é a cromatografia de 
troca iônica, o principio é o mesmo utilizado para os aminoácidos. 
 Coluna trocadora de cátions - liga e desliga moléculas com carga negativa. Coluna Obs.:
trocadora de ânions - liga e desliga moléculas com carga positiva. 
Posteriormente a cromatografia iônica podemos eluir de forma seletiva as proteínas que 
estão ligadas no interior do trocador: 
 Aumentando a concentração de sal, onde este compete pela carga do trocador e deslocar 
a proteína 
Gráfico 5- Razão Ve/V0 em função massa molecular de 
algumas proteínas. 
Gráfico 6- Purificação de uma enzima de 
granulócitos. 
Vivian Rocha 
 
52 
 
 Alterando o pH do tampão, onde esta alteração leva a uma mudança na carga da proteína 
perdendo assim a afinidade pelo trocador. 
 
Continuando o experimento da pág 51, onde aquela fração submetida na coluna de gel 
filtração agora é unida e aplicada a uma coluna de 
troca iônica. Essa coluna de troca iônica foi eluída 
com um gradiente de cloreto de sódio variando de 0 
ate 1 molar. E aquela fração que já tinha sido 
separada por tamanho foi agora separada por 
diferença de carga. Na origem antes de começarmos a 
larvar com sal saíram proteínas que não tinham 
afinidade pelo trocador (pico 1) e as frações 
numeradas de 2 a 7 são frações que foram eluídas em 
concentrações crescentes de sal. Novamente o 
pesquisador quantificou a atividade da proteína em 
todas as frações e observou que a proteína de interesse dele estava na região que corresponde ao 
pico 2. Nessa segunda etapa ele eliminou as demais proteínas que eram contaminantes. Ficando 
uma quantidade menor de proteínas que tem toda atividade original. A concentração proteica aqui é 
bem menor, no extrato original variava de 0 a 12, agora só varia de 0 a 0,4. 
Cromatografia de Afinidade 
Nessa cromatografia utilizamos uma coluna de agarose que vai conter um grupamento 
reativo que é o grupamento epox que pode reagir com vários grupamentos funcionais presentes em 
diversos tipos de moléculas. O epox pode reagir com o grupamento amino, carboxílico, sulfidrila... 
Então se você misturar a sua matriz de agarose ativada com esse epox com outra molécula 
que possua um desses grupamentos funcionais, você vai ter uma reação química que vai ligar 
covalentemente o ligante a sua matriz. 
 
 Figura 49- Coluna de agarose com grupamento epox. Figura 50- Grupamento reativo- Fósforo. 
 
Um exemplo disso seria essa situação acima (segunda figura) onde você tem a sua esfera, 
um grupamento reativo ao qual é ligado fósforo aminoácido que serve como sítio de ligação para 
uma proteína que se chama proteína ligadora de fósforo aminoácido. Podemos utilizar essa coluna 
que possui um fósforo aminoácido ligado para purificar especificamente essa proteína. As proteínas 
que não interagem com o fósforo os aminoácidos vão passar direto pela coluna arrastadas pelo fluxo 
de tampão. E aquelas proteínas que tiverem a capacidade de interagir com o aminoácido fosforilado 
Gráfico 7- Purificação de uma enzima de 
granulócitos. 
Vivian Rocha 
 
53 
 
vão se ligar ao aminoácido que vai estar ligado a matriz ficando imobilizada no interior da coluna, 
posteriormente é arrumado um método para fazer com que essa proteína se desligue da matriz. 
Uma das formas tradicionais de se fazer isso é aplicar na sua coluna uma solução de ligante 
livre. No nosso exemplo se é um fósforo aminoácido você aplica uma solução de fósforo 
aminoácido livre que ao passar pela coluna a proteína se desliga do fósforo aminoácido ligado e se 
liga ao fósforo aminoácido livre. Quando a proteína estiver ligada a esse fósforo aminoácido livre 
vai sendo arrastada pelo fluxo de solvente. Outra maneira de fazer com que sua proteína de 
interesse se desligue da matriz é alterando o pH, por que geralmente a interação da proteína com a 
molécula alvo é através de pontes de hidrogênio ou interações iônicas e se você altera o pH as 
cargas se desfazem e a afinidade da proteína pelo ligante é abolida. 
Cromatografia de afinidade é utilizada frequentemente para purificar IGG, nesse tipo você 
utiliza anticorpos que tem uma afinidade específica para determinado tipo de molécula. Você liga 
covalentemente a sua matriz os anticorpos de interesse. Depois aplica na sua coluna contendo os 
anticorpos ligados covalentemente a esfera a mistura de proteínas que você quer fracionar, como 
aquele anticorpo é especifico vai se ligar exclusivamente a proteína de interesse e as outras 
proteínas serão lavadas. Posteriormente você arranja uma forma de eluir às proteínas que ficaram 
ligadas aos anticorpos. 
Geralmente uma formar de eluir essa proteína e baixando o pH para 3. 
Eletroforese 
 Eletroforese: uma técnica de separação de baseada na migração de partículas 
carregadas sob a ação de um campo elétrico. 
 A eletroforese de proteínas é geralmente realizada em géis feitos de polímeros de 
acrilamida. 
 O gel de poliacrilamida atua como uma peneira molecular. A separação das proteínas é 
baseada na sua razão carga/massa. 
 A eletroforese na presença de SDS separa as proteínas com base em seu peso 
molecular. 
 
Na eletroforese sob condições não desnaturantes, um gel formado por monômeros de 
acrilamida de dois tipos diferentes são misturados em determinadas proporções, na presença de um 
agente que promove a polimerização, nesse caso geralmente é utilizado sulfato de amônio. 
Na formação desse gel existem espaçamentos entre as cadeias que formam uma determinada 
porosidade, a dimensão desse poro, ou desses espaçamentos entre as cadeias dos polímeros pode ser 
controlada aumentando ou diminuindo as concentrações dos dois tipos de acrilamida, de tal forma 
que podemos deslocar a reação para a formação de cadeias lineares com poucas ligações cruzadas 
ou então para a formação de cadeias com muitas ligações cruzadas que restringem o tamanho do 
poro dependendo do tipo de acrilamida. 
Essa solução geralmente é colocada entre duas placas de vidro e polimeriza no interior do 
gel, depois é aplicado um campo elétrico e a proteína começa a se deslocar através do gel pela ação 
do campo elétrico. Devido à porosidade teremos um efeito de peneira, as proteínas menores passam 
mais facilmente e as proteínas maiores passam com mais dificuldade. 
Com isso as proteínas menores vão migrar mais enquanto que proteínas maiores vão migrar 
menos. 
Vivian Rocha 
 
54 
 
Nesse sistema temos duas formas de promover essa separação: um sistema de gel nativo 
onde você não adiciona nem um agente desnaturante, consequentemente a proteína mantém a sua 
estrutura e a carga que aquela proteína vai possuir é a carga natural da proteína em um determinado 
pH. Nesse sistema de eletroforese nativa ou não desnaturante a separação é dada pela razão 
carga/massa da proteína, ou seja, quanto maior a carga mais rápido ela migra e quanto maior massa 
mais lentamente ela migra. 
Na eletroforese sob condições desnaturantes a proteína é tratada com dois agentes, o β-
mercaptoetanol que é uma molécula de etanol onde uma das hidroxilas é substituída por um 
grupamento sufidrila, esse grupamento 
sufidrila tem capacidade de fazer uma 
reação de substituição nas pontes de 
sulfeto que mantém as cadeias 
polipeptídicas das proteínas unidas, 
clivando essa ligação entre as cadeias 
laterais de Cisteína, gerando cadeias 
polipeptídicas livres. Então aquelas 
interações covalentes que eram mantidas 
entre cadeias polipeptídicas vizinhas por pontes de enxofre, que mantinham estabilizada a estrutura 
terciária da proteína, são desfeitas por ação do β-mercaptoetanol.
Além do β-mercaptoetanol que vai quebrar as pontes de sulfeto temos um detergente iônico 
que é o SDS, que além de desfazer a estrutura tridimensional da proteína este ainda é capaz de se 
ligar de forma estequiométrica ao longo da cadeia polipeptídica, então você tem mais ou menos a 
ligação de duas moléculas de SDS para cada resíduo de aminoácido, isso quer dizer que uma 
proteína que tem 100 aminoácidos liga 200 moléculas de SDS, uma proteína que tem 400 
aminoácidos vai ligar 800 moléculas de SDS. 
O SDS apresenta um grupamento sulfato na extremidade que tem uma carga negativa e essa 
ligação estequiométrica do SDS com a cadeia polipeptídica vai conferir uma quantidade elevada de 
cargas negativas à cadeia polipeptídica. Então uma proteína que tem 100 aminoácidos vai ter 
aproximadamente 200 moléculas de SDS e consequentemente ela vai ter 200 cargas negativas, uma 
cadeia polipeptídica com 400 aminoácidos vai ligar 800 moléculas de SDS e vai ter 
consequentemente 800 cargas negativas. Se você fizer a divisão a razão carga/massa dessas 
proteínas vão ser iguais, uma vez que a carga nativa da proteína vai estar presente em quantidade 
tão pequena que ela vai ficar diluída no meio de varias cargas negativas. Então todas as proteínas 
nesse sistema têm a mesma razão carga/massa. O que vai diferenciar a migração delas será 
simplesmente o tamanho. As proteínas muito grandes ficam retidas na malha do gel e migram muito 
pouco e enquanto que as proteínas pequenas passam com facilidade através da malha e vão migrar 
mais rapidamente. 
A mobilidade relativa de cada proteína é medida da mesma forma que o 
 , ou seja, a distância do ponto de aplicação ate o centro da macha 
cromatográfica dividido pela distância do ponto de aplicação ate o final do gel. 
É possível plotar essa mobilidade relativa de cada proteína se contra o 
logaritmo da base 10 da massa molecular da proteína, encontrando assim uma 
serie de pontos, onde é possível traçar uma reta. 
Figura 51- β-Mercaptoetanol. 
Figura 52 - Mobilidade 
relativa de uma proteína. 
Vivian Rocha 
 
55 
 
 Essa proteína da raia 4, será o objeto de estudo, onde sua massa molecular não é Ex.:
conhecida. Para descobrir a massa molecular dessa proteína é preciso calcular o , projetar isso na 
curva padrão e esse valor é extrapolado para o eixo do Y, encontrando assim a massa molecular da 
proteína desconhecida. 
Eletroforese não desnaturante 
Nessa eletroforese as proteínas migram de acordo com sua razão de carga/massa e 
consequentemente quando maior a razão carga/massa mais rápido aquela partícula vai migrar. Isso 
nada tem haver com o tamanho, pois você pode ter duas proteínas com tamanhos bastante similares, 
mas que tem a mesma razão carga/massa e migram de forma semelhante. 
Quanto maior a razão carga massa mais rápido a proteína vai se deslocar no campo elétrico. 
Eletroforese sob condições desnaturantes 
O outro tipo de eletroforese que é realizado sob condições desnaturantes na presença de um 
detergente iônico que é o dodecil sulfato de sódio ou SDS e β-mercaptoetanol. Uma vez dissolvida 
em uma solução contendo esses dois agentes essa solução proteica é aquecida, o que leva a 
completa desnaturação da estrutura proteica, perdendo sua estrutura quartenária, terciária e estrutura 
secundária, permitindo a interação estequiométrica da molécula do detergente com a cadeia 
polipeptídica de tal forma que as proteínas ficam homogeneamente ligadas com a molécula de 
detergente adquirindo a carga negativa daquela molécula. Por tanto todas as proteínas vão possuir a 
mesma razão carga/massa e nesse caso especifico a única coisa que vai restringir a movimentação 
da partícula através do gel é o tamanho da cadeia polipeptídica. Sendo assim quanto maior a cadeia 
polipeptídica maior restrição à movimentação e, portanto menor será a migração e quanto menor a 
cadeia polipeptídica mais fácil ela passa pela malha do gel e consequentemente mais rápido ela vai 
migrar. 
Isoletrofocalização 
Outra técnica cromatográfica é a isoletrofocalização ou focalização isoelétrica. Onde as 
proteínas são separadas com base na diferença de ponto isoelétrico, em função de cada proteína 
possuir um ponto isoelétrico especifico. 
Se por exemplo dissolvêssemos uma mistura de proteínas 
em um tampão de pH 7, as proteínas que possuírem um pI = 7 
terão carga liquida 0, as proteínas que tiverem pI menor do que 
pH vão possuir carga liquida negativa e as proteínas que tiverem 
pI maior do pH vão possuir carga positiva. 
Nessa técnica um gradiente de pH é gerado ao longo de 
uma matriz que é formada por um gel de poliacrilamida. Esse 
gradiente de pH é formado através de uma cuba contendo em sua 
parte superior uma solução de base forte NaOH (OH
-
) e na sua 
parte inferior uma solução ácida (H
+
) como, o ácido fosfórico. A 
esse sistema é aplicado um potencial elétrico, ou seja, uma 
corrente elétrica continua é ligada nessa cuba. Com a aplicação do 
campo elétrico os íons OH
-
 vão começar a migrar para o pólo da parte superior e os íons H
+
 
começam a migrar para parte inferior, essa migração de OH
-
 e H
+
 ao longo do gel vai forma um 
Figura 53 - Isoletrofocalização. 
Vivian Rocha 
 
56 
 
gradiente de pH, onde será mais ácido na extremidade inferior e a medida que vamos nos 
distanciando desse ponto a concentração de H
+
 vai diminuindo, por outro lado teremos um pH 
bastante básico em cima em função da concentração de OH
-
. 
Além desse gradiente de pH que é formado naturalmente, é preciso estabilizar esse gradiente 
através de uma mistura de substancias de baixo peso molecular que são conhecidos como , anfólitos
que possui essa estrutura geral ao lado. Que possui dois 
grupamentos ácidos, onde o R pode ser um H ou (CH2)n COOH. 
À medida que as moléculas vão migrando dependendo de 
suas cargas, o pH vai se modificando, se com isso aqueles 
grupamentos ácidos e básicos da molécula vão mudando de 
estado iônico ate chegar ao ponto onde pH do gradiente será igual ao pI da molécula, nesse ponto a 
molécula fica com carga liquida 0 e para de migrar. 
Em uma etapa seguinte as proteínas carregadas negativamente são aplicadas no topo do gel e 
devido ao pH elevado, estas vão migrar ao longo do gradiente do pH, a medida que isso ocorre ela 
vai alterando a carga ate chegar a um ponto onde o pH de um determinada região será igual ao pI 
dessas proteínas, onde esta fica com carga liquida 0 e para de migrar. 
Com isso teremos a separação de um número relativamente grande de proteínas, pois cada 
uma delas parou de migrar em uma região de pH que será igual ao seu pI (exemplo da figura 52). 
Essa técnica de fracionamento consegue separar proteína que diferem em relação à outra proteína 
em cerca de 0,05 unidade de pH, possuindo assim uma resolução relativamente grande. 
Eletroforese Bidimensional 
De uma maneira geral essa eletroforese bidimensional é baseada no acoplamento de duas 
técnicas de separação que é a isoeletrofocalização que geralmente é usada na primeira dimensão 
seguida da eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições 
desnaturantes. Então na primeira dimensão as proteínas são separadas de 
acordo com o pI, essas proteínas separadas no gel são colocadas no topo 
em um gel de poliacrilamida com SDS e com isso as proteínas que 
foram separadas na primeira dimensão começam a ser separadas na 
segunda dimensão com base na diferença de tamanho. Como ilustra a 
figura ao lado. 
Quando separamos por tamanho, essas bandas mais intensas 
geralmente ao em vez de conter uma cadeia polipeptídica, podem conter 
varias cadeias, 1,2, 3 ou mais proteínas que possuem o mesmo pI, mas 
tem massa molecular diferente. 
Geralmente
se fizermos somente a primeira técnica conseguimos separar por volta de 80 a 
100 proteínas, se só fizermos a segunda conseguimos separar por volta de 50 a 80 proteínas 
diferentes, agora quando as duas técnicas são utilizadas consecutivamente conseguimos obter mapas 
proteicos bastante complexos contendo milhares de proteínas diferentes. 
Esses mapas bidimensionais podem ser usados para comparar os tipos de proteínas 
expressos, por exemplo, por duas células em condições fisiológicas diferentes, então comumente os 
cientistas fazem isso para comparar proteínas produzidas por uma linhagem de célula normal com a 
mesma linhagem de célula só condição transformada, descobrindo quais proteínas são expressas de 
Figura 54 - Anfólito. 
Figura 55 - Eletroforese 
Bidimensional. 
Vivian Rocha 
 
57 
 
forma diferencial nas duas condições e tentar correlacionar essas diferenças de expressão proteica 
com o fenótipo apresentado por aquela célula. 
Esses mapas bidimensionais também são utilizados para estudos de proteoma. Onde 
podemos identificar cada um desses sptos proteicos se tivermos o genoma do organismo já 
sequenciado. Isolando cada um desses spots proteicos e in vitro e tratando com uma protease sítio 
específica, uma das proteases usadas no estudo de proteoma é a tripsina, essa tripsina é uma 
hidroprotease que geralmente cliva a cadeia polipeptídica depois de uma Arginina ou depois de uma 
Lisina. A massa de cada um desses peptídeos gerados é analisada na solução contendo esses 
fragmentos proteicos, através de uma técnica espectrometria de massa, com essa técnica 
conseguimos determinar a massa molecular de cada um desses peptídeos com uma resolução menor 
do que 1 dalton, que seria a diferença de uma massa de H. Então tem uma determinação bastante 
precisa. Comparando esse resultado experimental com o resultado das proteínas do genoma do 
organismo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Vivian Rocha 
 
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AULA 6 - SEQUENCIAMENTO DE PROTEÍNAS 
O sequenciamento de proteínas é uma técnica importante para descobrir a ordem na qual os 
aminoácidos estão presentes na cadeia polipeptídica. Inicialmente por volta de 1945-50 o único 
modo de saber a sequência de aminoácidos de uma proteína era através da purificação desta e 
fazendo a determinação dessa sequência diretamente a partir dessa proteína purificada. 
Atualmente há uma forma bem mais barata de sequenciar uma proteína que é através do 
conhecimento da sequência do seu gen. Basicamente existem duas formas de determinar a 
sequência da proteína. A primeira forma seria clonando o gen correspondente aquela determinada 
proteína e sequenciando a estrutura daquele gen. Mas nesse método nem sempre a sequência de 
nucleotídeos obtida na ORF vai lhe fornecer a informação fiel de qual seria a sequência de 
aminoácidos da proteína. Isso porque muitos organismos possuem a estrutura do gen interrompida 
por íntrons, apesar de poder predizer computacionalmente quem são os éxons e quem são os íntrons 
e montar a estrutura da proteína a partir dos éxons preditos, muitas vezes temos um splicing 
diferencial onde um éxon pode ser omitido na estrutura final do mRNA. Com isso temos que alguns 
organismos, um gen, pode dar origem a 11 cadeias polipeptídicas diferentes, não tendo, portanto 
como predizer de antemão como aquele RNA contendo os íntrons será processado. Algumas vezes 
a proteína depois de sequenciada sofre processamentos, onde parte da estrutura primaria original é 
retirada por proteólise, podendo haver a retirada de determinados trechos do n-terminal ou do c-
terminal da proteína ou ainda a proteína pode ser clivada na região central dando origem a dois 
peptídeos diferentes faltando aquela parte que unia anteriormente essas proteínas. Um exemplo 
disso é a insulina que é sintetizada originalmente como uma cadeia polipeptídica única e após o 
processamento a proteína madura contem duas cadeias polipeptídicas isoladas, porque a cadeia 
original foi clivada por uma protease e um pedaço da proteína foi perdido. 
Portanto muitas vezes para conhecermos a estrutura nativa da proteína preciasamos 
sequenciar aquela cadeia polipeptídica porque na maioria da vezes a informação contida no gen não 
é exatamente aquela que é encontrada na proteína final madura. 
Para sequenciar essas proteínas a primeira coisa que precisamos ter é uma preparação pura, 
isso quer dizer, que a preparação precisa ter única e exclusivamente a cadeia polipeptídica que 
queremos sequenciar. 
Uma vez que escolhemos um 
organismo modelo a partir do qual vamos 
obter a proteína, precisamos fracionar 
aquele extrato proteico utilizando uma 
serie de técnicas diferentes de 
fracionamento para que ao longo dessas 
técnicas vá se eliminando as proteínas 
contaminantes e no final obtenhamos 
uma preparação que terá única e 
exclusivamente a proteína queremos 
sequenciar. E a partir dessa preparação 
pura é preciso fazer várias etapas para 
determinar a sequência de aminoácidos 
daquela proteína. 
Figura 56 - Sequenciamento de proteínas. 
Vivian Rocha 
 
59 
 
O primeiro procedimento é fazer a hidrolise da proteína, essa hidrolise envolve a quebra das 
ligações peptídicas que mantinham os diferentes aminoácidos unidos e no final desse processo de 
vai ter uma “sopa” de aminoácidos, a partir dessa “sopa” vamos identificar os tipos de aminoácidos 
presentes na proteína e quantas vezes aquele aminoácido esta presente na cadeia polipeptídica. 
Então nessa primeira etapa na realidade determinamos a composição de aminoácidos na sua 
proteína. Isso tem uma utilidade pratica, pois depois que montamos a sua proteína vamos encontrar 
uma sequência de aminoácidos e vamos precisar verificar se a sequência obtida é consistente com a 
composição. Então veremos se todos os aminoácidos que achamos que existia nesta proteína através 
da analise da composição vão estar presentes na sequência final, se não tiver é porque perdemos 
alguma coisa no meio do caminho. 
Depois de fazer o sequenciamento da proteína usualmente reduz as pontes de sulfeto 
presentes nela e detecta o aminoácido presente na extremidade amino terminal ou na extremidade 
carboxi terminal. Existem metodologias por meio das quais podemos fazer esta determinação e com 
o conhecimento do aminoácido localizado nas extremidades da sua cadeia polipeptídica ela ter 
fornece um ponto de orientação para começar a montar a estrutura da proteína. 
Existem vários reagentes que podem ser utilizados r para promover essa determinação e 
alguns nos vamos mostrar nessa aula. 
Depois de termos feito isso, pegamos outra amostra da proteína com as pontes de sulfeto 
reduzidas e trata essa proteína isoladamente com pelo menos dois métodos distintos de clivagem da 
cadeia polipeptídica. 
Nesse exemplo (figura 55) temos primeiramente a proteína clivada com que é uma tripsina
endoprotease sítio especifica que sempre vai quebrar a cadeia polipeptídica depois dos aminoácidos 
 ou que são aminoácidos que possuem cadeias laterais com cargas positiva e Lisina Arginina
vamos obter uma serie de peptídeos derivados dessa proteína. 
Posteriormente ao tratamos essa proteína com outra forma de clivagem especifica nesse caso 
foi utilizado brometo de cianogênio que cliva depois de e obtemos o segundo Metionina
conjunto de peptídeos. 
De posse desses peptídeos purificamos cada um deles e para fazer o sequenciamento desses 
peptídeos através de uma metodologia chamada de sequenciamento de Edman. 
Como sabemos qual é o primeiro aminoácidos dessa proteína? O primeiro aminoácido da 
proteína esta localizado na extremidade n-terminal,
nesse caso é o ácido glutâmico. 
Vamos ver detalhadamente cada uma dessas partes: a hidrolise, a determinação do n-
terminal, a fragmentação da proteína de forma especifica com determinados tipos de reagentes 
químicos ou endoproteases sítio especificas, o sequenciamento desses peptídeos obtidos e o 
alinhamento final do conjunto de peptídeos para montar a estrutura primária da proteína. 
Preparo da Proteína para o Sequenciamento 
 Determinar o número e tipos de subunidades presentes na proteína 
 Clivar as pontes de enxofre (se houver) 
 Purificar cada uma das subunidades 
 Determinar a composição de aminoácidos de cada subunidade 
 Determinar o resíduo N-terminal 
Vivian Rocha 
 
60 
 
Antes de iniciar o processo de sequenciamento existem algumas etapas que precisamos 
realizar para preparar a proteína para o sequenciamento. 
A primeira coisa é purificar a proteína, depois caracterizar, ou seja, temos que determinar 
quantos tipos de subunidades estão presentes na proteína, porque nessa metodologia de 
sequenciamento temos que sequenciar uma cadeia polipeptídica de cada vez, se a proteína possuir 
duas cadeias polipeptídicas diferentes começamos a retirar aminoácidos de uma e de outra não 
sabemos se o aminoácido vem da cadeia A ou da B. Então primeiro precisamos caracterizar a 
proteína para saber quantos tipos de subunidades diferentes ela tem e se ela tiver mais de um tipo de 
subunidade precisamos purificar, separar aquelas subunidades e sequenciar as subunidades 
isoladamente. A segunda coisa a se fazer é clivar as pontes de enxofre (pontes de sulfeto) que a 
proteína possuir e a partir dai determinar a composição de aminoácidos de cada subunidade e por 
fim precisamos determinar o resíduo n-terminal. 
A purificação e caracterização da proteína são etapas essenciais. 
I. Redução das Pontes Dissulfeto 
A clivagem da ponte de sulfeto pode ser feita de duas formas distintas. Ela pode ser feita de 
uma forma oxidativa através da utilização do ácido performico, onde este cliva a ponte de sulfeto e 
transforma o enxofre em grupamentos de ácidos sistêmicos, essa metodologia tem a vantagem que 
de o ácido sistêmico não consegue reagir novamente para formar as pontes de sulfeto entre tanto o 
ácido performico modifica a cadeia lateral da Metionina que tem um enxofre presente. Por causa 
dessas modificações secundarias os pesquisadores preferem não utilizá-lo mais. Um método 
alternativo é a utilização de , que promove o rompimento da ponte de sulfeto β-mercaptoetanol
gerando duas Cisteínas livres e esse método tem como inconveniente de que se deixarmos o β-
mercaptoetanol por um tempo longo o suficiente essas pontes de enxofre voltam a se formar 
espontaneamente. Com isso precisamos fazer um segundo tratamento que geralmente é feito 
utilizando ácido iodo acético que reage com o grupamento sufidrila livre acetilando aquele 
grupamento e esse grupamento acetilado ele não volta a formar ponte de sulfeto. 
II. Composição de Aminoácidos da Proteína 
Precisamos então determinar a composição de aminoácidos da proteína isso é feito 
incubando a cadeia política original com ácido clorídrico concentrado a cerca de 6 molar e aquecido 
em uma atmosfera de nitrogênio a cerca de 110
o 
C por 24 horas e isso ataca as ligações peptídicas 
gerando os aminoácidos livres. De posse dessa “sopa” de aminoácidos podemos, por exemplo, 
modificar o aminoácido promovendo derivado florescente daqueles aminoácidos e aplica os 
aminoácidos a uma coluna de HPLC e identificar os aminoácidos presentes e a quantidade em que 
eles estão presentes na proteína através do tempo de retenção e a intensidade da florescência. 
Vivian Rocha 
 
61 
 
Existem alguns problemas com essa metodologia. O primeiro problema é que essa hidrolise 
ácida promove a completa destruição do Triptofano, então não conseguimos codificar ele na sua 
estrutura primaria. Por outro lado ele promove uma 
hidrolise parcial da Serina, Treonina e da Tirosina e 
precisamos fazer experimentos adicionais para 
determinar a quantidade desses aminoácidos na sua 
mistura. A hidrolise ácida ainda além de quebrar a 
ligação peptídica ela cliva a ligação amida presente 
cadeia lateral da Asparagina e da Glutamina, 
transformado as em Ácido Aspártico e Ácido Glutâmico 
respectivamente. 
Portanto precisamos fazer um segundo tratamento 
para fazer a determinação do Triptofano e geralmente a 
determinação do Triptofano é feita através de um 
hidrolise alcalina que é realizada com NaOH concentrado 
a 100 graus centigrados por um tempo que varia de 4 a 8 
horas esse método tem a desvantagem de promover a 
decomposição completa de Cisteína, Serina e Treonina. 
Ele promove a desaminação e a racemização de 
todos os outros aminoácidos, mas ele permite a 
quantificação do Triptofano. Então na realidade o 
objetivo desse segundo tratamento e de apenas 
determinar o Triptofano, coisa que não podia se fazer na 
hidrolise alcalina. 
Na tabela ao lado temos dois experimentos de 
determinação da composição de aminoácidos que é do 
citocromo C bovino e de outra proteína bovina. Elas 
possuem os 20 aminoácidos, mais estes estão presentes em quantidades diferentes. Então aqui já 
sabemos a composição de aminoácidos da proteína, então o passo seguinte é determinar o resíduo n-
terminal que é o primeiro aminoácido da proteína ou resíduo que esta na extremidade c-terminal 
que o último aminoácido da proteína. 
III. Determinação do Resíduo N-terminal 
Isso é feito reagindo à proteína com um composto químico flúor 2,4 de nitrobenzeno. Esse 
composto químico tem a capacidade de reagir com o grupamento amino livre do primeiro 
aminoácido, então o primeiro aminoácido da sua cadeia polipeptídica fica marcado com esse 
composto que é florescente. Depois de fazer esta marcação à cadeia polipeptídica é hidrolisada com 
ácido clorídrico concentrado todas as ligações peptídicas são clivadas ficando com uma “sopa” de 
aminoácidos e um deles marcado com um composto florescente. Essa mistura é aplicada na coluna 
de HPLC e o único aminoácido a ser detectado será o n-terminal. 
 
 
 
Tabela 7- Composição de aminoácidos de 
duas proteínas. 
Vivian Rocha 
 
62 
 
IV. Determinação do Resíduo C-terminal 
O método mais simples de detectar o c-terminal é através da analise do tratamento da cadeia 
polipeptídica com uma . Uma carboxipeptidase é uma enzima que cliva a ligação carboxipeptidase
entre o ultimo e o penúltimo aminoácido liberando o ultimo aminoácido, quando o ultimo 
aminoácido é liberado o penúltimo aminoácido vira o último e a enzima vai atacar ele também e 
quando este é retirando o antepenúltimo aminoácido vira o ultimo aminoácido que será clivado 
também. Isso quer dizer que na realidade para fazer a determinação do aminoácido por essa 
metodologia iniciamos a reação e de tempos em tempos vai retirando uma alíquota da sua reação e 
paralisando a reação. Depois de um tempo apareceu um pico no cromatograma na posição 
correspondente a Metionina, então o ultimo aminoácido é uma Metionina, depois de 20 min alem da 
Metionina ele observou o segundo pico na posição correspondente a Glicina, então o segundo 
aminoácido é a Glicina em 30 min ele observou outro pico que é a Valina que deve ser o terceiro. 
Apesar de ser atrativo este método não serve para sequenciar, pois só é possível sequenciar 
ate o penúltimo aminoácido depois disso o cromatograma começa a ficar cheio de picos de 
tamanhos iguais e não é possível determinar a ordem com a qual aqueles picos foram gerados. 
V. Sequenciamento da Cadeia Polipeptídica 
 Fragmentar a cadeia polipeptídica em locais específicos de modo a gerar peptídeos 
pequenos o suficiente para serem sequenciados
diretamente 
 Purificar cada fragmento 
 Determinar a sequência de aminoácidos de cada fragmento purificado 
 Repetir as etapas anteriores usando peptídeos obtidos a partir do uso de outro método 
de clivagem 
Já reunimos um conjunto de informações a respeito da sua cadeia polipeptídica. Já sabemos 
a composição, sabemos o primeiro aminoácido e sabemos quais terminam esta cadeia. Agora 
precisamos começar a sequenciar a cadeia polipeptídica. 
A primeira coisa a ser feita é fragmentar a cadeia polipeptídica em locais específicos de 
modo a gerar peptídeos pequenos o suficiente para serem sequenciados diretamente pelo método de 
Edman. Depois de fazer essa fragmentação com um tratamento enzimático químico, precisamos 
purificar cada um dos fragmentos gerados pelo processo de hidrolise, determinar a sequência de 
aminoácidos de cada fragmento purificado e repetir todo procedimento utilizando uma segunda 
metodologia de fragmentação. E a partir dos dados obtidos com os dois sequenciamentos tentar 
montar a sequência real da cadeia polipeptídica completa. 
Para clivar a proteína podemos se valer de enzimas que são endopeptidases e sítio 
. Existem varias enzimas disponíveis comercialmente com essa finalidade. Como por especificas
exemplo, , , , , e . Cada a tripsina quimiotripsina elastina termolisina pesina endopeptidase V8
uma delas cliva a cadeia polipeptídica em um ponto especifico. 
A cliva depois (do lado C) da Lisina ou Arginina, quando não exista uma Prolina tripsina
depois. 
A cliva depois de Triptofano, Tirosina e felialnanina se o aminoácido quimiotripsina
seguinte não for uma Prolina. 
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Outra forma de clivar a proteína se não quisermos utilizar enzimas é utilizar um reagente 
químico que é o que vai atacar a ligação peptídica sempre depois de uma brometo de cianogênio
Metionina e vamos ter a fragmentação na cadeia sempre depois daquele aminoácido. Novamente 
como a ligação é quebrada na extremidade c-terminal do aminoácido o último aminoácido que 
sofreu a clivagem será sempre uma Metionina. 
O sequenciamento é efeito inicialmente mobilizando o polipeptídio em uma matriz, 
adicionamos esse peptídeo imobilizado a um reagente que é fenilisotiocianato que tem a capacidade 
de reagir com o grupamento amino livre formando um derivado do seu aminoácido, trocamos o 
ambiente do seu reator e retira o solvente aquoso alcalino e substitui pelo Ácido Trifluoracético 
Anidro (sem água) e na presença desse ácido o reagente ao seu ultimo aminoácido ataca a ligação 
peptídica liberando o último aminoácido na forma livre sob a forma de um derivado.