Slide Da Profª. Valdirene Leão Carneiro [Fisiopatologia E Farmacoterapia I] - 2011.1 - PRINCIPAIS TÉCNICAS LABORATORIAIS IMUNOLÓGICAS (IMUNOENSAIOS)

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Técnicas imunológicasTécnicas imunológicas
Valdirene Leão
Interações Ag-Ac 
secundárias
PRINCÍPIOS BÁSICOS
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO –
Í ÁPRINCÍPIOS BÁSICOS
• As reações de aglutinação baseiam-se na formação de 
agregados/ aglomerados resultantes da interação Ag-g g g ç g
Ac, que ocorre em zona de equivalência, quando pelo 
menos um desses componentes está na forma 
particuladaparticulada.
• Pode ocorrer tanto com partículas que apresentam Pode ocorrer tanto com partículas que apresentam 
determinantes antigênicos naturais em sua superfície 
(ex.: hemácias, bactérias, vírus), como em partículas 
i t ( lát f lá ti ) él l inertes (ex.: látex, esferas plásticas ) ou células que 
são recobertas com uma das moléculas, mais 
comumente o Ag.m m g
Tipos de Reações de AglutinaçãoTipos de Reações de Aglutinação
l i ã Di Ti í i • Aglutinação Direta: Tipagem sanguínea e sorotipagem 
bacteriana;
• Teste de Inibição da Aglutinação Direta: Rubéola, 
Influenza Enterovírus Influenza, Enterovírus ...
• Aglutinação Indireta ou Passiva: • Aglutinação Indireta ou Passiva: 
Hemácias: Toxoplasmose, Chagas ...
Lát x: F t um tóidLátex: Fator reumatóide
Micropartículas de Gelatina: Anti-HTLV
Teste de Aglutinação PassivaTeste de Aglutinação Passiva
HemaglutinaçãoHemaglutinação
Uso comum da aglutinação:Uso comum da aglutinação:
Tipagem sanguínea por aglutinaçãoTipagem sanguínea por aglutinação
Aglutinação do látex (Prot C Reativa)Aglutinação do látex (Prot. C Reativa),
Diagnósticos indiretos de infecçãog ç
Detecção de componentes
VDRL - Venereal Disease Research Laboratory - usada para detectar Ac reativo 
no teste de sifilis . “False positive test -- such as HIV, Lyme disease, mycoplasma 
pneumonia, malaria, and systemic lupus erythematosus. Therefore, thispneumonia, malaria, and systemic lupus erythematosus. Therefore, this 
screening test if found to be positive must be confirmed by a more specific test 
for syphilis such as FTA-ABS.” 
Floculação – Antígenos cardiolipínicos – suspensão de cristais de 
Colesterol-cardiolipina.
RPR – Antígenos cardiolipínicos adsorvidos em partículas de carvão.
http://www.bmb.leeds.ac.uk/mbiology/ug/ugteach/icu8/std/vdrl.html
Detecção de componentes
TPPA (Treponema Pallidum Particle-Agglutination) test, 
Particulas de gelatina com antigenos treponêmicos são aglutinados 
por anticorpos em soros positivos. p p p
http://www.bmb.leeds.ac.uk/mbiology/ug/ugteach/icu8/std/tpha.html
Reações de Precipitação
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• Complexos moleculares gerados a partir da interação de Ag 
solúveis com Ac específicos tendem a precipitar em um determinado 
meio. 
• Este fenômeno permitiu o desenvolvimento de técnicas em que se• Este fenômeno permitiu o desenvolvimento de técnicas em que se 
observa a formação do precipitado, o que só é possível se o Ac e o Ag 
interagirem.
• Técnicas utilizando a precipitação em meio líquido são raramente 
utilizadas (e somente em pesquisa) para verificação da resposta deutilizadas (e somente em pesquisa), para verificação da resposta de 
um animal a um dado antígeno solúvel. 
•Algumas técnicas foram desenvolvidas a partir da observação de que 
Ag - Ac precipitam em meio semi-sólido, tipo gel (em geral de 
)agarose).
Ex: - Imunodifusão dupla
- Imunodifusão radial
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Imunodifusão radial 
- Imunoeletroforese
Curva de Equivalência
É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac 
em diferentes concentrações dos mesmos. Observe abaixo: 
+ - -Anticorpo livre +
+- -
Anticorpo livre
Antígeno livre
100%--
Percentual de
lcomplexo
imune
precipitado
Zona de excesso
de anticorpo
Zona de 
equivalência
Zona de excesso
de antígeno
12
Quantidade de antígeno adicionado 
Imunodifusão simples radialImunodifusão simples radial
• O Ac é 
incorporado ao p
ágar e colocado 
em uma placa deem uma placa de 
Petry.
é f• No centro é feito 
um orifício e nele 
é colocado o Ag 
a ser testado.a ser testado.
I dif ã i l di lImunodifusão simples radial
Imunodifusão radialImunodifusão radial
Um exemplo de sua utilização: dosagem de 
imunoglobulinas numa placa disponível no
mercado.
Poços onde são colocados padrões e amostras a serem dosados
Halo de precipitação
IgG – anti-IgGIgG – anti-IgG
Agarose contendo anticorpos
anti IgG humana PLACA PARADOSAGEM DE I G HUMANAanti-IgG humana PLACA PARA DOSAGEM DE IgG HUMANA
NefelometriaNefelometria
É d d d d d l d f• É uma medida da dispersão de luz de uma fon-
te luminosa. Em soluções diluídas, a reação de 
ã í precipitação entre antígeno e anticorpo pro-
duz um aumento da reflexão que pode ser me-
d d l d ã d l ddido pela dispersão de uma luz incidente.
• Ex: Igs Complemento proteínas séricasEx: Igs, Complemento, proteínas séricas...
NefelometriaNefelometria
Raios de uma fonte de 
luz de alta intensidade 
são dirigidos por lentessão dirigidos por lentes 
focalizadoras.
Passam através da 
amostra contendo o 
complexo Ag-Ac. Raios 
que emergem numque emergem num 
ângulo de 70° são 
dirigidos por outra lente 
para o detectorpara o detector 
eletrônico e o sinal pode 
ser matematicamente 
relacionado com arelacionado com a 
concentração de Ac ou 
Ag da amostra.
Nefelometria/TurbidimetriaNefelometria/Turbidimetria
I õ A A Interações Ag-Ac 
primáriasprimárias
Í ÁPRINCÍPIOS BÁSICOS
Imunofluorescência
IMUNOFLUORESCÊNCIAIMUNOFLUORESCÊNCIA
Detecção de componentesç p
Imunofluorescencia - usada para detectar Ac reativo no teste de sifilis 
FTA ABS Fl t T l A tib d Ab ti T tFTA-ABS = Fluorescent Treponemal Antibody Absorption Test
(Treponema pallidum)
http://www.dasit.it/DISEASE/autoimmunita/others.html
Radioimunoensaio
ELISA – PRINCÍPIOS BÁSICOSELISA PRINCÍPIOS BÁSICOS
• O ELISA é um teste para identificação e quantificação
de Ag ou Ac presentes em amostras e fluidos biológicos
(como soro ou saliva).
• Seu princípio está baseado numa interação primária Ag-
Ac visualizada através de uma reação enzimáticaAc, visualizada através de uma reação enzimática.
•A reação ocorre em meio líquido e a atividade enzimática
é proporcional à concentração de Ag ou Ac da amostra.
A enzima converte um substrato incolor em produto• A enzima converte um substrato incolor em produto
colorido ou o substrato alterado pela enzima induzirá
mudança de cor de uma substância indicadora. A leituramudança de cor de uma substância indicadora. A leitura
é realizada num fotocolorímetro.
ELISA PRINCÍPIOS BÁSICOSELISA – PRINCÍPIOS BÁSICOS
• O teste é, geralmente, realizado em placas plásticas de
microtitulação de fundo chato, com 96 poços, dispostos
em 12 colunas de 8 poços, marcadas lateralmente e na
parte s perior da placaparte superior da placa.
Cont. negativo
Cut-off
Nos poços são colocadas concentrações adequadas de
Cut off
Cont. positivo
• Nos poços são colocadas concentrações adequadas de
Ag ou de Ac no suporte sólido. Adiciona-se a amostra a
ser testada e reagentes, Ag ou Ac, conjugados comser testada e reagentes, Ag ou Ac, conjugados com
enzimas.
ELISA “SANDWICH”
Outros componentes do soro
Antígeno a ser dosado Anticorpo primário
Anticorpo conjugado
TMB
Enzima Peroxidase
ELISA DE CAPTURA
Anticorpo anti-IgM
IgM a ser detectada
IgM inespecífica
Antígeno biotinilado
TMB
ST-AV- Peroxidase
ELISA INDIRETA
Antígeno purificado IgM a ser detectada
IgM inespecífica
Anticorpo conjugado
TMB
ELISA
¾Quantificação de Ag/Ac em ELISA:
ELISA por competição
1. Placa de Elisa revestida com Ac específico
2. Adição de Ag-teste:
Adição de Ag-marcado:
Competição para ligar Ac
3. Lavagem para retirada de excesso de Ag
4. Quanto maior a quantidade
de Ag-teste, menor a 
possibilidade de ligação do Ag marcado e assim, 
menor a intensidade de cor emitida 
Equipamento automátco para realização de 
“ELISA” modelo “Eti-star” da “Diasorin”
Equipamento automático paraEquipamento automático para 
realização de “ELISA”, modelo “ 
Magia”, da “Merck”
E a quimioluminescência?E a quimioluminescência?
• Quais são os elementos mais utilizados? 
Quimioluminescência 
http://www.chm.uri.edu/chempeople/ebotonjicdir/luminol.html
Na quimioluminescência 
O substrato quimioluminescente sofre
hidrólise na presença da enzima,p ç ,
produzindo substâncias instáveis que
culminam com emissão de luzculminam com emissão de luz.
Inicio como no Ensaio Imunoenzimático Convencional
IMUNOQUIMIOLUMINESCENCIA 
Lavagem para retirada de Ag não 
Inicio como no Ensaio Imunoenzimático Convencional
fixado:
Adição de Ac monoclonal, anti-Ag 
i d j d à ipesquisado, conjugado à enzima .
O conjunto é incubado
Lavagem para retirada de Ac 
conjugado à enzima, não fixado
Adição de substrato da enzima 
O substrato quimioluminescente sofre
hidrólise na presença da enzimahidrólise na presença da enzima,
produzindo substâncias instáveis que
culminam com emissão de luz
O exemplo acima é o que acontece com o substrato luminescente (p.ex.:AMPPD).
A substância luminescente pode ser desestabilizada por uma súbita mudança do
pH e da concentração do meio (éster de acridina) ou ainda um elemento, como
por exemplo o rutênio, dissociado do Ag ou do Ac por uma descarga elétrica no
final da reação, culminando com a emissão de luz. A imunoluminescência pode
atingir uma sensibilidade de 10-15 a 10-16g.
Quimioluminescência 
http://www.chm.uri.edu/chempeople/ebotonjicdir/luminol.html
Imunocromatografia g
http://webdb dmsc moph go th/ifc nih/a nih 2 003c asp?info id=438http://webdb.dmsc.moph.go.th/ifc_nih/a_nih_2_003c.asp?info_id=438
Padronização de DOT-ELISA
BruceloseBrucelose 
“Western Blotting”
O desenvolvimento do teste 
(como exemplo: detecção de 
anticorpos anti – HIV em 
soro):
Vírus HIV
soro):
As proteínas do vírus 
HIV são dissociadas em 
SDS
Separação dos Ag por - +
35 68 45 12
eletroforese em gel de 
poliacrilamida (PAGE)
- +
Os Ag são eletrotrasnferidos para o 
papel de nitrocelulose, onde reagirão 
com os Ac do soro do pacientep
O SDS (dodecil sulfato de sódio) 
é um detergente!
Ac anti-Ig humana, ligado a 
enzima, detecta as proteínas 
produzindo um produto final 
que reagirá com o cromógeno
95 45 24
que reagirá com o cromógeno 
adicionado !
Os equipamentos necessários:Os equipamentos necessários:
Resultado de um teste
para HIV:para HIV:
160
PM
(KDa)
41
fontes de corrente contínua e cubas uti-
(KDa)
24
fontes de corrente contínua e cubas uti
lizadas para a transferência eletroforética Análises ---------- CP CN Teste
Mini “bloter”Mini bloter
http://www.immunetics.com/products/miniblotters/minijpeg%20copy.jpg
http://myhome.naver.com/biologian/western_blot.jpg
htt // bi / i t/U l dFil /200408/20040803130738478 if
p y g _ jpg
http://www.fermentas.com/techinfo/electrophoresis/img/blotting.gif
http://www.bioon.com/experiment/UploadFiles/200408/20040803130738478.gif
Fundamento e técnica do Southern Blot 
http://www.bio.miami.edu/dana/250/southern.jpg
O QUEACONTECE COM O Európio?O QUE ACONTECE COM O Európio? 
Elemento muito utilizado na imunofluorimetriaElemento muito utilizado na imunofluorimetria ...
Referências 
• Antonio Walter Ferreira - Sandra Lago Moraes de Ávila DIAGNÓSTICO• Antonio Walter Ferreira - Sandra Lago Moraes de Ávila DIAGNÓSTICO 
LABORATORIAL DAS PRINCIPAIS DOENÇAS INFECCIOSAS E AUTO-
IMUNES Edição/Ano: 2/2001 nº págs: B/443 .( ultima edição )
• Vaz, A. J.; Takei, K.; Bueno, E.C. Imunoensaios: Fundamentos eVaz, A. J.; Takei, K.; Bueno, E.C. Imunoensaios: Fundamentos e 
Aplicações. 1 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007
• Janeway, C. and Travers, P. Imunobiologia: O Sistema Imune na Saúde 
e na Doença 4a ed Porto Alegre: Artes Médicas ultima ediçãoe na Doença. 4a ed. Porto Alegre: Artes Médicas, - ultima edição .
(VEM COM CD ROM) 
• Peakman, M. and Vergani, D. Imunologia Básica e Clínica. Rio de 
Janeiro: Guanabara Koogan, 1999 .( ultima edição )Janeiro: Guanabara Koogan, 1999 .( ultima edição )
• Roitt, I.; Brostoff, J. and Male, D. Imunologia. 1a ed. São Paulo:Manole, 
1999. . ultima edição )
• Stites, D.P., Tem, A.I. and Parslow, T.G. Imunologia Básica e Clínica, 9aStites, D.P., Tem, A.I. and Parslow, T.G. Imunologia Básica e Clínica, 9a 
ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000. .( ultima edição )
• Manual de equipamento Abbot
• Site www.labimuno.org.brSite www.labimuno.org.br
• http://quimica_basica.sites.uol.com.br/tabelap.htm