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Química Analítica Biotecnológica 
 
 
 
A cromatografia liquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas (LC-MS/MS) vem 
mostrando ser uma excelente ferramenta no diagnóstico precoce de doenças neoplásicas. A Zn-2 
glicoproteína (ZAG) é uma proteína relativamente abundante que tem sido utilizada como biomarcador 
para o câncer de próstata, mama e bexiga. A ZAG é uma glicoproteína com massa molar de 
aproximadamente 41.000 Da. Bioquimicamente, a ZAG estimula a degeneração lipídica em adipócitos e 
parece estar envolvida na caquexia, uma doença degenerativa que pode afetar pessoas com câncer, 
AIDS e outras doenças terminais. A ZAG pode ser encontrada naturalmente em muitos fluidos 
biológicos, tais como sangue, cerebroespinal, urina e outros. Estudos prévios mostram que em casos de 
tumores malignos existe um aumento expressivo de ZAG no sangue. Nesses estudos, as 
concentrações de ZAG encontradas em pacientes saudáveis e com câncer de próstata foi de 3,65 mg/L 
e 7,59 mg/L, respectivamente. Portanto essas análises por LC-MS/MS são auxiliares no diagnóstico de 
câncer de próstata e não conclusivos. Os dados abaixo se referem a um estudo realizado com 30 
pacientes saudáveis e 30 pacientes que apresentavam sinais clínicos de câncer de próstata. Nesse 
estudo, uma proteína idêntica a ZAG foi sintetizada por técnicas de biologia molecular. Essa proteína 
quando analisada por LC-MS/MS, produz um fragmento abundante em 892 m/z 
(EIPAWVPFDPAAQITK) no primeiro quadrupolo (Q1). Esse fragmento resulta em 3 principais 
fragmentos em Q3, correspondentes a 892→355; 892→728; 892→1088 (Figura 2). A transição 
892→1088 foi utilizada para análises quantitativas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1- Cromatograma obtido por LC-MS/MS relativo ao estudo realizado. Condições cromatográficas: Coluna C18 (50 x 2.1 
mm x 5 µm), volume de injeção 10 µL, vazão 250 µL/min. Fase móvel: Solvente A (solução aquosa de acetato de amônio e 
ácido fórmico); Solvente B (solução metanólica de acetato de amônio e ácido fórmico). Gradiente: Inicio com 5% de B por 2 
min, aumento para 95% de B até 24 min, manter 95 de B por 2 min, voltar para 5% de B em 1 min e manter essa proporção até 
30 min. 
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Figura 2-Espectro de massa (MS/MS) da ZAG 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabela 1-Curva analítica para análise da ZAG. Critérios de aceitabilidade: RSD < 15%; r  0,98 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabela 2- Dados relativos as análises dos voluntários 
 
 
 
 
Conc (mg/L) Área ZAG Área PI
0,10 8765 5498
0,20 8123 2548
0,40 32456 5248
0,80 64578 5412
1,00 78900 5482
5,00 371111 5236
10,00 667899 4587
Área Média Área Média
ZAG Pi
voluntários saudáveis 273708 5234
voluntários com suspeita 567876 5123
n = 30
RSD < 5%
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1) Quanto a cromatografia liquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas: 
a) Nas análises envolvendo LC-MS existe a necessidade do uso de interfaces, entre essas se 
destacam: a “electrospray ou eletronebulização” (ES); a ionização química a pressão atmosférica 
(APCI) e a ionização por impacto eletrônico (IE); 
b) A alta concentração iônica e alto teor de água na fase móvel é essencial na ionização química a 
pressão atmosférica (APCI); 
c) As análises envolvendo LC-MS/MS apresentam alta sensibilidade e moderada seletividade; 
d) Na eletronebulização, as moléculas dos analitos são ionizadas e volatilizadas pela ajuda de um feixe 
de elétrons provenientes do capilar presente na interface; 
e) A análise do espectro de massas juntamente com o tempo de retenção de um determinado analito é 
empregada em analises qualitativas. 
 
2) Na análise anterior da ZAG por LC-MS/MS: 
a) Uma amostra analisada foi descartada pois apresentou as seguintes transições do espectro de 
massas no Q3 (892→335; 892→750; 892→1088); 
b) Trata-se de uma análise otimizada de forma errada, pois o padrão interno possui um tempo de 
retenção muito próximo ao do analito (ZAG), portanto prejudicando a análise quantitativa; 
c) A fase móvel empregada apresenta sais voláteis o que pode prejudicar as análises qualitativas, pois 
a evaporação dos mesmos leva a modificações na fase móvel e portanto na reprodutibilidade dos 
tempos de retenção; 
d) O gradiente empregado na análise reduz o tempo de análise, pois a maior concentração de água na 
fase móvel durante o gradiente desloca o analito reduzindo assim o tempo de retenção; 
e) Nesse método, diminuindo a força da fase móvel, os analitos eluirão mais rapidamente. 
 
3) Quanto as amostras dos voluntários: 
a) A concentração de ZAG na amostra de voluntários suspeitos e na amostra de voluntários sadios é 
superior ao encontrado em estudos prévios; 
b) Os valores encontrados nesses voluntários corroboram com os estudos prévios descritos; 
c) A concentração de ZAG nas amostras de voluntários suspeitos é de 1,2 µg/mL; 
d) É impossível determinar a concentração nas amostras analisadas, pois a curva analítica apresenta 
valores de RSD e coeficiente de correlação inferior ao recomendado pela legislação para bioanálise; 
e) Dada a concentração encontrada, provavelmente os voluntários suspeitos não apresentam câncer de 
próstata. 
 
4) Quanto as condições cromatográficas do estudo acima: 
a) As condições empregadas são típicas condições encontradas no modo fase normal aquosa; 
b) Quanto menor a altura equivalente a um prato teórico maior a eficiência da coluna e, portanto maior o 
número de prato teórico; 
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c) Uma forma de diminuir o tempo de análise nesse método seria empregar uma coluna octilsiloxano 
(C8) e uma fase móvel mais polar; 
d) Uma melhor eficiência pode ser conseguida pela diminuição da vazão da fase móvel, pois o termo A 
da equação de Van Deemter terá menor influência; 
e) Diminuindo o tamanho da partícula da fase estacionária a altura equivalente a um prato teórico 
diminui devido a menor influencia do termo B da Equação de Van Deemter. 
 
O biodiesel, combustível renovável e biodegradável, constituído de uma mistura de ésteres, é produzido 
a partir da reação de transesterificação de um triglicerídeo, óleo vegetal, com um álcool de cadeia curta, 
normalmente, metanol ou etanol. A presença de metanol ou etanol no produto final, em concentrações 
superiores ao especificado pela legislação vigente, interfere no ponto de fulgor, propriedade importante 
dos combustíveis, e que está relacionada com o transporte dos mesmos. Pela resolução 42 da ANP, o 
teor máximo permitido para álcool (metanol ou etanol), no biodiesel, é de 0,50 % m/m. Uma amostra de 
biodiesel (1 grama) suspeita de adulteração foi analisada (em quintuplicata). Os cromatogramas e 
dados relativos à amostra estão descritos abaixo. Considere tM como 0,5 min. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Quadro 1-Condições de análise do biodiesel de mamona 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3-Cromatograma relativo a análise do metanol e etanol no biodiesel de mamona 
. Condições de Análise
Cromatógrafo à gás : HP 6890 
Amostrador Automático: HP 7673
Coluna: 100% metil silicone , 30m x 0,32mm x 3µm.
Tforno : 50ºC (6 min) 20ºC/min  260ºC (50 min)
Padrão interno: Terc-butanol
Gás de arraste: Hidrogênio (12 psi) 
Volume de amostra: 1,0µL
Injetor: split-spltless T injetor : 175ºC Vazão split = 50mL/min
Detetor : FID (DIC) T detetor : 260°C
Vazão do Nitrogênio de “make up” : 30mL/min
Vazão do hidrogênio para o detetor: 30 mL/min
Vazão
de ar sintético para o injetor: 400 mL/min
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Tabela 3-Curva analítica para análise do metanol e etanol no biodiesel de mamona. Critérios de aceitabilidade: RSD < 15%; r  0,99 
 
 
 
 
 
 
 
Tabela 4- Resultado das amostras de biodiesel de mamona. Critérios de aceitabilidade: RSD < 5% 
 
5) Quanto aos detectores empregados em cromatografia gasosa: 
a) No detector de ionização em chamas, a captura dos elétrons formados é proporcional a corrente 
gerada e, portanto a concentração da amostra; 
b) Na escolha do gás de arraste deve ser considerado o tipo de detector empregado. Assim o nitrogênio 
e o argônio acrescido de metano são ideais para serem empregados com o detector de captura de 
elétrons; 
c) Nos detectores empregados em cromatografia gasosa, o único que não destrói a amostra é o 
termiônico, sendo portanto, ideal para análises em escala preparativa; 
d) A grande vantagem do detector de ionização em chama é sua alta afinidade por compostos que 
contenham nitrogênio e fósforo em sua estrutura; 
e) O detector termiônico é ideal para análises de compostos que tenham átomos eletrofílicos, como Cl, 
em sua estrutura. 
 
6) Quanto às condições de análise do biodiesel: 
a) Pela análise da coluna empregada, o mecanismo de separação é a partição; 
b) O tipo de injeção empregada é ideal para análise de traços, onde pequenas quantidades de analitos 
estão presentes na amostra; 
c) Pelas características demonstradas, a coluna empregada é uma coluna recheada analítica; 
d) Essa análise emprega o modo isotérmico de separação, onde a temperatura do forno aumenta 
durante a análise dos compostos; 
e) Todas as alternativas estão corretas. 
Conc (mg/g) Área Metanol Área Etanol Área PI
0,10 4563 8765 5498
0,20 4521 8654 2548
0,40 18978 32456 5248
0,80 36854 64578 5412
1,00 45215 78900 5482
1,50 65248 123456 5236
2,00 75001 154678 4587
Replicatas Área Metanol Área Etanol Área PI
Amostra 1 21990 32468 5214
Amostra 2 22456 31245 5142
Amostra 3 20987 32778 5234
Amostra 4 21345 30987 5024
Amostra 5 22154 31246 5198
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7) Na análise do cromatograma; 
a) O tempo de retenção ajustado para o metanol e etanol, é respectivamente, 0,7 e 0,4; 
b) O fator de retenção do Pi é superior a 1,75; 
c) O fator de separação entre os picos do etanol e do PI é inferior a 1,0; 
d) O fator de retenção do metanol e do terc-butanol, é respectivamente, 0,8 e 1,4. 
e) O fator de separação entre o metanol e etanol é inferior a 1,5. 
 
8) Em relação a concentração de etanol e metanol na amostra: 
a) A amostra analisada apresenta valores superiores 1000% de metanol, provavelmente devido a 
contaminações entre as injeções ou resíduos presentes na seringa de injeção; 
b) A concentração de metanol e etanol encontrada na amostra de biodiesel é inferior a 0,1%; 
c) A concentração de metanol na amostra é 0,29%; 
d) Não é possível determinar a concentração de metanol e etanol na amostra pois a curva analítica 
apresenta coeficiente de correlação e/ou desvio padrão relativo acima do permitido; 
e) A amostra de biodiesel analisada não atende as especificações da ANP quanto o teor de metanol e 
etanol.