P1-IMUNOLOGIA

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PRÁTICAS
OBTENÇÃO E CONSERVAÇÃO DE SORO E PLASMA
- Sangue total - anticoagulante inibe a cascata de coagulação sanguínea
Por que o sangue não coagula no organismo? Existência de pró-enzimas de ativação; 
Final do processo: transformação do fibrinogênio (solúvel) em fibrina; O2 é um meio de ativar a cascata de coagulação.
Procedimentos para coleta e preparo do soro (sangue total - elementos figurados - sistema enzimático de coagulação e seus substratos)
1) Fazer a coleta de acordo com o indivíduo e a necessidade de sangue - SEM ANTICOAGULANTE
2) transferir para tubos de ensaio
3) Colocá-los em temperatura ambiente, omais inclinado possível de modo a se obter o coágulo mais fino (aumentar superfície de contato com o ar, coagula mais eficientemente)
4) Após coagulação descolar os coágulos e levar em banho maria por 30min a 37°C, para o coágulo dilatar e liberar o soro aprisionado dentro dele. Importanto uma temperatura não tão elavada para não romper hemácias -> sangue hemolisado pode interferir no resultado do exame
5) Aspirar o sobrenadante e centrifugar -> separar os elementos figurados que se desprenderam do coágulo no banho maria
6) Aspirar o soro e passar para um frasco apropriado
7) Rotular 8) Estocar
Por que ficar em jejum antes do exame de sangue? Valores normais para quem está em jejum de 8 a 12 horas, ficar sem comer ou comer algo em excesso pode alterar o resultado do exame.
PRECIPITAÇÃO DE GAMA-GLOBULINAS PELO SULFATO DE AMÔNIO A 33%
Pode-se dividir o soro em porções de proteínas -> anticorpos de concentram na porção gama (são precipitadas a concentração de 33%). A separação de outras frações é necessária uma maior concentração. 
Por que separar as gama globulinas? Diminui as chances de reação de hiperssensibilidade às proteínas do soro. É um método inespecífico de separação.
1 volume de sulfato de amônio para 2 volumes de soro -> para conseguir a concentração final de 33%
Gota a gota e sob constante agitação -> se adicionar de uma vez, pode criar proporções diferentes ao primeiro momento, precipitando as outras frações de proteínas.
Manter sob agitação por 1 hora -> proporciona a máxima precipitação (dá chance da maioria das moléculas entrarem em contato com gama-globulina)
Centrifugação decanta as gama globulinas -> ressuspender o precipitado em um volume que totalize o original do soro (em solução salina)
Remoção do sulfato de amônio pela diálise contra solução salina fisiológica ou PBS (moléculas tendem a atingir o equilíbrio osmótico)
Testar a pureza -> Reativo de Nessler; caso seja detectada amônia na amostra, repetir todo o procedimento.
Método específico: cromatografia por afinidade
Ag grudado por reação química nas pérolas de sefarose. Soro colocado na coluna, Ac reagem com Ag e se ligam nas pérolas. Lavar a coluna com PBS.
Como tirar o Ac da coluna: Altera-se o pH do meio e consequentemente a carga dos anticorpos -> vão se desligar dos Ag.
Desvantagens: baixo rendimento, apenas um tipo específico de Ag, nem todo Ag consegue grudar na pérola e ligação covalente precisa resistir às alterações de pH.
AGLUTINAÇÃO DIRETA
Interação Ag-Ac por forças não covalentes torna-se uma reação reversível; ocorre por meio de forças de Coulumb, propriedades hidrofóbicas, PH e forças de Van der Waals. Quanto mais específico, reação mais forte. Interações mais fracas se desmembram mais fácil, ex: reação cruzada.
Reações sorológicas in vitro.
Fatores que influenciam:
	Osmolaridade e pH (uso de soluções isotônicas)
	temperatura 
	acidez e afinidade
	tempo de reação (varia em função da natureza do Ag - particulado ou solúvel-menor tempo de reação*****; natureza do Ac-depende da classe - IgM-mais rápida e mais facilmente visualizada)
	concentração dos reagentes - está relacionada à zona de equivalência; excesso de antígeno ou anticorpo pode levar a falsos resultados negativos
	Efeito pró-zona: falso negativo quando há excesso de Ac no soro, onde não se observa a aglutinação. Pode ser evitado com a realização da diluição, de modo a se obter equivalência na concentração dos reagentes, faixas onde serão observadas os efeitos desejados (positivo). Com a diluição do soro, também se obtém uma ideia da concentração de de anticorpos.
Título: avalia a intensidade das reações sorológicas; é semi-quantitativo e dado pela maior diluição do soro em que se observa determinado efeito.
AGLUTINAÇÃO INDIRETA
Antígeno está ligado a uma partícula de modo artificial. Possibilidade da obtenção de reações de aglutinação, mais visíveis e mais rápidas que as reações de precipitação.
TEÓRICA
INTRODUÇÃO À IMUNOLOGIA
Resposta Imunitária = tudo que acontece no nosso organismo como consequência da interação com um agente etiológico ou corpo estranho (antígeno) em relação ao patrimônio genético do organismo.
Imunógeno (antígeno) - toda substância capaz de induzir uma resposta imunitária.
Sistema Imunitário = conjunto de tecidos, células e moléculas com função de proteger o organismo.
	Funções: defesa (mecanismos de reconhecimento e eliminação de patógenos), imunovigilância (reconhece e elimina células tumorais), imunidade (proteção do organismo), homeostasia (eliminação de células mortas provenientes do catabolismo).
A imunidade inata inclui mecanismos moleculares e celulares predispostos antes mesmo de uma infecção, preparados para prevenir ou eliminá-la. Esta primeira linha de desefsa, altamente efetiva, previne a maioria das infecções em seu início ou as elimina em poucas horas após o encontro com o sistema imune inato. Os elementos de reconhecimento do sistema imune inato distinguem precisamente entre o seu próprio organismo e os patógenos; entretanto, eles não são especializados na distinção de pequenas diferenças das moléculas estranhas. Uma segunda forma de imunidade, conhecida como imunidade adptativa, desenvolve-se em resposta a uma infecção e adpta-se para reconhecer, eliminar e então relembrar o patógeno invasor. A imunidade adptativa sucede a imunidade inata, iniciando poucos dias após a infecção inicial. Ela fornece uma segunda e completa linha de defesa, que elimina os patógenos que escapam das respostas inatas ou que persistem apesar delas. Uma consequência importante da RI adaptativa é a memória. Se o mesmo patógeno, ou um outro intimamente relacionado, infecta o organismo, as células de memória fornecem os mecanismos para o sistema imune adaptativo fazer um ataque rápido e frequentemente efetivo contra os patógenos invasores.
RESPOSTA IMUNE NATURAL
É imediada, não específica, relativamente menos potente, não deixa memória imunológica, não aumenta com exposição prévia, constituída por barreiras físicas, químicas e celulares.
Provas da sua efetividade: previne invasão da flora normal (somos continuamente expostos e povoados por MO, mas raramente eles nos causam doenças), proteção contra agentes selvagens.
Barreira física, processos mecânicos (fluxo de fluidos, movimento ciliar, tosse), flora normal, agentes tóxicos (lisozima, HCl), fagocitose, ação lítica
Resistência celular: Fagócitos (principalmente neutrófilos, secretam mediadores inflamatórios, secreção de citocinas), NK (marcam e matam células infectadas por vírus-liberação de moléculas citotóxicas), Citocinas (ativam outras células, como macrófagos, NK), complemento (matam o MO por lise, promovem inflamação, contribuem na fagocitose)
Muitas das moléculas envolvidas na imunidade inata possuem a propriedade de reconhecimento de padrões, a capacidade de reconhecer uma determinada classe de moléculas. Como certas classes de moléculas são exclusivas a alguns micróbios e não são encontradas em organismos multicelulares, a habilidade de reconhecer imediatamente e combater invasores exibindo tais moléculas é uma forte característica da imunidade inata.
Interação com moléculas do hospedeiro por PPR (receptores que reconhecem padrões presentes nos Antígenos (PAMPs). Grupo mais improtante de PPR: receptores Toll-Like. Ao serem detectados pelas PPR, ocorre inflamação → concentra elementos da imunidade
inata no local e pode levar ao recrutamento da RI adquirida.
RESPOSTA IMUNE ADQUIRIDA
Específica (diferencia cepas de MO), demorada, relativamente mais potente, deixa memória imunológica, aumenta com exposição prévia.
Exposições futuras ao mesmo Ag resultam em uma resposta de memória: a RI ao segundo desafio ocorre mais rapidamente do que no primeiro, é mais forte e em geral mais efetiva na neutralização e eliminação do patógeno.
Devido à necessidade de algum tempo para ordenação das respostas imunes adaptativas, a imunidade inata fornece a primeira linha de defesa durante o período crítico, exatamente após a exposição do hospedeiro ao patógeno. Em geral, a maior parte dos MO encontrados por um indivíduo saudável é prontamente eliminada dentro de poucos dias pelos mecanismos de defesa do sistema imune inato antes mesmo da ativação do adaptativo. Devido a esse atributo, o SI pode conferir imunidade durante toda a vida contra muitos agentes infecciosos após um contato inicial.
As 2 respostas combinadas produzem uma resposta combinada mais efetiva do que cada resposta isolada.
Tipos: Humoral e Celular (pode haver interação entre esses 2 ramos).
Fases:
Reconhecimento - receptores específicos para o Ag para que haja ativação da RI
Amplificação - amplifica as células capazes de atuar sobre o Ag
Efetuação - eliminação do Ag 
Humoral: Ly B - seleção do clone que é capaz de interagir com o Ag. Expressam um tipo de receptor de ligação de antígeno em sua membrana. Antes do primeiro contato, são poucos circulantes. Reconhecimento direto via anticorpos ou Ig de membrana → a ligação do Ag ao Ac leva a uma rápida multiplicação → produção de plasmócitos que vão produzir Ac, e produção de células de memória. Após a amplificação, há muitas células capazes de reconhecer esse Ag.
Celular: Ly T - TCR (receptor de célula T) reconhece antígenos após processamento e apresentação por APCs. Interage apenas com os antígenos que contém proteína (pedaços da parte proteica é que são expressados na membrana da APC).
	CD4+ = aumenta eficiência e focaliza RI natural → ajudam as outras células a desempenharem suas funções -> aumenta macrófagos, PMN, NK, melhora processo inflamatório ao secretar citocinas.
	CD8+ = linfócito citolítico -> reconhece células infectadas e as destrói.
NATUREZA CLONAL DA RI ADQUIRIDA
Cada Ly expressa receptores que reconhecem uma única especificidade. A distribuição clonal faz com que haja poucos Ly específicos para cada Ac, pouco frequentes para produzir uma RI efetiva. Quando um Ly virgem é sensibilizado por um Ag, este é capaz de gerar milhares de Ly geneticamente idênticos a ele, o que aumenta a frequência desse clone no organismo. Após sucessivas multiplicações, se um limiar for atingido, a ação protetora acontece, e a RI passa a ser muito mais rápida em um segundo contato com o Ag, e consequentemente mais eficiente, eliminando o Ag antes que ele cause danos ao organismo. Consequência = memória imunológica, onde o número de Ly específicos para um determinado antígeno é bastante aumentado, e as células de memória possuem um tempo de vida mais longo do que os Ly virgens.
IMUNÓGENOS
Bactéria é um mosaico antigênico - composta por vários antígenos diferentes. Cada antígeno não é reconhecido inteiro, e sim em porção denominadas epítopos. Logo, cada um deles é capaz de estimular um clone diferente da RI -> vários clones diferentes estimulados e a RI é mais eficiente.
Cada indivíduo pode responder a Determinantes Antigênicos diferentes do mesmo antígeno.
TIPOS DE ANTÍGENO
Quanto à constitução química: proteínas, lipoproteínas, polissacarídeos
Quanto à valência: monovalente (epítopo único), multivalente (epítopos com a mesma especificidade), polivalente (epítopos com especificidades diferentes -> mais eficiente a RI porque estimula vários clones).
Quanto à forma de apresentação: In natura (ao LyB diretamente-pode ser de qualquer constitução química), Processado (ao LyT)
Quanto à necessidade de ativação de LyT para a produção de Ac: Timo-independentes (não induz memória imunológica, mesmo nível de Ac produzidos, só produz IgM), Timo-dependentes (LyB internaliza o Ag, processa e coloca na superfície para sinalizar o LyT, que estimula o LyB a produzir Ac, ocorre aumento no nível de resposta)
Quanto à reatividade imunológica: Ag completos (imunogenicidade e antigenicidade), Ag incompletos (apenas antigenicidade, não estimulam a RI a menos que estejam ligados a proteína carreadora; são os haptenos).
Quanto à reatividade com o Ac: homólogo, heterólogo (reação cruzada devido ao compartilhamento ou semelhança de epítopos)
TIPOS DE DETERMINANTES ANTIGÊNICOS
Quanto à forma: conformacional (depende da estrutura tridimensional, caso mude a conformação, não reage mais), linear: continua reagindo mesmo após a desnaturação da molécula.
Quanto à posição: não-superpostos (mais Ac conseguem reagir, maior a ação efetora), superpostos (sequências incomum, interferem na reatividade, pois um Ac interfere que o outro epítopo reaja com outro Ac devido ao impedimento espacial)
IMUNOGENICIDADE
Distância filogenética - capacidade da molécula ser reconhecida como estranha
Tamanho molecular - maior n° de epítopos, e moléculas grandes são mais facilmente fagocitadas.
Complexidade molecular - maior imunogenicidade
Natureza química - proteínas ótimos imunógenos, polissacarídeos raramente bons, ativam predominantemente LyB, outras substâncias são imunógenas apenas quando formam complexos com proteínas
Acessibilidade aos DA - fímbrias de bactérias
Fatores relacionados à forma de administração do Ag> oral, parental, intravenosa, dose, estafo físíco, com ou sem adjuvantes (alúmen é o único aprovado para uso humano)
Fatores relacionados ao indivíduo - genótipo influencia no grau e tipo da RI, estado físico (fatores metabólicos e nutricionais).
ANTICORPOS
São encontrados de 2 formas: como constituintes das células B, ligados à membrana, ou como moléculas solúveis secretadas pelos plasmócitos. Atuam como efetores da imunidade humoral à procura de antígenos, marcando-os para eliminação. Em geral, as população de Ac produzidas em resposta a um determinado estímulo antigênico são heterogêneas, devido à variedade de epítopos na estrutura dos Antígenos.
ESTRUTURA
2 cadeias leves e 2 pesadas, ligadas por pontes dissulfeto
porções variáveis em relação à sequência de aa, porções hipervariáveis (formam o sítio de ligação com o epítopo - mais externas), porção constante.
Digestão proteolítica produz 3 fragmentos. 2 idênticos (Fab - de ligação ao antígeno = 2 sítios de ligação ao epítopo iguais no mesmo Ac), e 1 Fc (fragmento cristalizável formado apenas por cadeias pesadas)
Cadeias podem formar dobras - domínios - regiões globulares devido a pontes dissulfeto intracadeias.
Dobradiça na parte central, importante pois possibilita a movimentação dos “braços” do Ac, facilitando a captação do Antígeno.
VARIANTES
Regiões variáveis nas cadeias leves -> não influencia na atividade do Ac (kappa e lambda)
Regiões variáveis nas cadeias pesadas -> pequenas variações na Fc, formando 5 diferentes isotipos que não diferem na mesma espécie. Cada um deles tem funções diferentes no organismo.
Alótipos -> pequenas diferenças entre os aa baseadas em diferenças genéticas entre os indivíduos da mesma espécie, em locos normalmente conhecidos.
CLASSES
IgM - 5 unidades, produzida na fase aguda da doença, forma monomérica aparece na membrana do LyB, ativa o complemento, devido ao seu grande tamanho não se difunde bem, confinada ao sist. circulatório
IgG - monomérica, principal Ig sérica, há 4 subclasses e IgG4 não ativa o complemento. Atravessa a barreira placentária, desempenhando papel importante na proteção do feto em desenvolvimento, característica da RI secundária, fase crônica da doença. Geralmente produzida por células de memória.
IgAs - dimérica, presente nas secreções, importante na imunidade local das mucosas, forma barreira contra vírus, micróbios e alérgenos. Presente no leite materno
→ proteção ao RN
IgA - monomérica presente no sangue, antiviral, fica complemento via alternativa.
IgE - algumas células (mastócitos, basófilos) possuem receptores para a Fc da IgE. Participa de reações alérgicas e anafiláticas → causa liberação de substâncias dos mastócitos que causam os sintomas de hiperssensibilidade. Aumentada nas infecções parasitárias → ligação aos eosinófilos.
IgD - baixa concentração no soro, expressas na membrana do LyB, é lábil.
ATIVIDADES BIOLÓGICAS DOS Ac
Neutralização de vírus e Neutralização de toxinas - interage e bloqueia ligação ao receptor
Opsonização - células fagocíticas têm receptores para Fc de IgE e IgG principalmente; Ag recoberto pelo Ac propicia que haja interação com a célula fagocítica; Ac serve como ponte → prente o patógeno à membrana do fagócito. Se um Ag é coberto com o Ac antiquado, o complexo formado se liga mais rapidamente aos receptores de Ac da membrana dos macrófagos do que ao Ag sozinho, facilitando a fagocitose.
ADCC (citotoxidade celular mediada por Ac) → principalmente no caso de Ag muito grandes, como células tumorais; permite a liberação de substâncias tóxicas como a perfurina; Importante porque enzimas não são específicas para o Ag → evita que tenha efeito nas células normais.
Hiperssensibilidade imediata.
ÓRGÃOS LINFOIDES
locais de geração e maturação de linfócitos (OL primários), e ativação da RI adquirida (OL secundários)
Medula Óssea - hematopoiese, forma pré-LyT e LyB por estímulos às células do estroma que se diferenciam
Timo - córtex superficial - LyT imaturos, córtex profundo: LyT maduros; produz LyT maduros, ocorre a geração de receptores de LyT (TCRs) ao acaso pelo rearranjo gênico, controla a qualidade e a quantidade, por meio de uma seleção rigorosa que elimina LyT não-funcionais ou auto-reativos.
Linfonodos - filtram a linfa, estão localizados por todo o corpo no trajeto dos vasos linfáticos. A linfa passa lentamente pelo linfonodo, permitindo que substâncias estranhas sejam capturadas. Após a infecção do organismo, a linfa que deixa o nódulo em um único vaso linfático eferente é enriquecida com anticorpos recentemente secretados, e contém uma concentração maior de linfócitos que a linda aferente. Córtex superficial: LyB nos folículos linfoides, córtex profundo: LyT espalhados, Medula: células circulantes (principalmente LyB nos cordões medulares)
Baço - enquanto os linfonodos são especializados no aprisionamento dos Ag dos tecidos locais, o baço é especializado em filtrar e aprisionar os antígenos presentes no sangue → artéria esplênica. Polpa branca contém as células linfoides: LyT na bainha linfoide periarteriolar e LyB nos folículos secundários.
Vasos Linfáticos - possuem estrutura especial para que haja fluxo de líquido. Camada única de células endoteliais fracamente justapostas. Mesmo que os capilares estevam fechados, a arquitetura dos poros dos vasos primários permite a entrada de fluidos e até meso de células na rede linfática. Dentro destes vasos, o fluido, agora denominado linfa, flui da rede de tubos finos para uma série de vasos progressivamente mais largos denominados vasos linfáticos. Os linfócitos, as células dendríticas, macrófagos e outras células também podem atravessar as finas paredes das células endoteliais, fracamente unidas, dos vasos linfáticos, juntando-se ao fluxo de linfa. Quando um antígeno estranho penetra os tecidos, ele é colhido pelo sistema linfático (que drena todos os tecidos do organismo) e é conduzido para diversos tecidos linfoides, como os linfonodos, que aprisionam o Ag estranho. Conforme a linfa passa dos tecidos para os vasos linfáticos, ela se torna progressivamente enriquecida com linfócitos. Assim, o sistema linfático também serve como um meio de transporte dos linfócitos e dos antígenos, do tecido conjuntivo para os tecidos linfoides organizados, onde os Ly podem interagir com o Ag aprisionado e sofrer ativação.
RECIRCULAÇÃO DOS LY
Uma vez que os linfócitos maduros tenham sido gerados nos órgãos linfoides primários, eles circulam no sangue e no sistema linfático, uma rede de vasos que coleta o fluido que vaza dos capilares do sistema circulatório para os tecidos. Por fim, estes fluidos que vazam retornam para o sangue.
Ly circulam constantemente pela circulação sanguínea e linfática, e essa recirculação constitui um mecanismo de monitoramento constante de todas as partes do organismo.
A linfa, que é recolhia dos espaços intersticiais das partes do corpo é drenada para a veia subclávia direita. Os Ly assim caem na circulação sanguínea, e o sangue entra no linfonodo pela artéria linfática. Na altura da vênula pós-capilar, encontram-se células especializadas que permitem a passagem dos linfócitos para o parênquima do linfonodo = vênulas de endotélio alto.
RI - CAPTAÇÃO DO Ag
Pode ser captado por células dendríticas, que vão levá-lo até o linfonodo mais próximo, de forma a ativar os LyT
Ag pode cair na circulação sanguínea, e vai ser levado até o baço
Ag pode cair na circulação linfática (drenado do interstício). Sozinho no linfonodo pode ativar os LyB
CIRCULAÇÃO DOS PRODUTOS DA RI HUMORAL E CELULAR
LyT efetores chegam pela circulação sanguínea até o foco infeccioso -> interagem com o epitélio do capilar e passam para dentro do tecido.
Anticorpos também caem na circulação até o foco infeccioso → permeabilidade vascular é aumentada e mais substâncias passam com o plasma.
RI - ELIMINAÇÃO DO Ag
Anticorpos → opsonização, neutralização de vírus, toxinas, ativam o complemento, etc.
CD4+ → melhoram resposta imune natural, ajuda CD8+ liberando substâncias que facilitam a digestão do Ag.
Em um processo infeccioso viral, CD8+ interage com as células infectadas e as destrói.
APCs
Captam, processam e apresentam Ag para os LyT
- Células dendríticas: capta Ag no foco infeccioso, é ativada e liberada na circulação. É levada até os OL secundários, onde vai ativar a RI adquirada.
- Macrófago: não tem a capacidade de sair do foco infeccioso e ir até o OL secundário → logo, não inicia a RI. Atua na efetuação da RI, onde apresenta o Ag para o LyT CD4+ que vai liberar substâncias ajudando o macrófago a fagocitar o Ag.
- LyB apresenta Ag para conseguir efetuar a RI humoral → essencial para a formação de Ac dependente de LyT.