Prática 6 - Enzimas I

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Professor Alexandre Soares dos Santos DCB/UFVJM 2007 
Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri 
Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde 
Departamento de Ciências Básicas 
Disciplina: Bioquímica 
 
AULA PRÁTICA Nº 6 – ENZIMAS: ESPECIFICIDADE, TERMOLABILIDADE E CINÉTICA 
 
 
As enzimas são responsáveis pela catálise e controle da maioria dos processos 
metabólicos numa célula. Elas são de natureza protéica e aumentam a velocidade de 
reações químicas, através da diminuição da energia de ativação requerida. Possuem 
como principais características: (i) grande especificidade pelo(s) substrato(s); (ii) grande 
eficiência de catálise e (iii) efeito saturante do próprio substrato. Há na estrutura da 
enzima, uma determinada região diretamente responsável pela ação catalítica. Essa 
região é denominada sítio ativo e a sua conformação correta é fundamental para a 
atividade enzimática. Ali se localizam diversos resíduos de aminoácidos que podem 
desempenhar funções de orientação do substrato e direta interação com este, permitindo 
que a reação ocorra. Assim, quaisquer agentes capazes de promover mudanças 
conformacionais na estrutura protéica, como variação de temperatura, pH e força iônica, 
por exemplo, podem afetar a atividade enzimática. 
Em 1913, L. Michaelis e M.L. Mentem, desenvolveram estudos considerando as 
principais propriedades das enzimas e aplicando as teorias conhecidas de Cinética 
Química para um modelo simplificado, o qual envolvia a enzima livre (Eo), o substrato 
(S), o complexo enzima-substrato (ES) e o produto (P). Esse modelo pode ser expresso 
como: 
 
K1 K2 
E + S ES E + P 
 K-1 
 
Michaelis e Mentem, com essas considerações, desenvolveram a expressão de 
velocidade para uma reação catalisada enzimaticamente e desta forma puderam 
descrever o comportamento de diversas enzimas. Essa expressão está apresentada 
abaixo. 
 Vmáx . [S] 
 V = 
 Km + [S] 
 
As reações catalizadas por enzimas que se identificam com o modelo micaeliano 
possuem um perfil hiperbólico, onde a velocidade inicial da reação varia com o aumento 
da concentração de substrato conforme mostrado na figura abaixo. 
 
 
Professor Alexandre Soares dos Santos DCB/UFVJM 2007 
Objetivos: Observar a especificidade enzimática pelo substrato, a termolabilidade das 
enzimas e verificar o comportamento cinético da ação da α-amilase salivar na catálise 
da hidrólise do amido. 
 
Materiais e Reagentes 
 
Solução de sacarose a 3 g% 
Solução de sacarase a 3 g% 
Reagente de Benedict 
Solução de amido a 1 g% 
Saliva 
Lugol 
 
Procedimentos 
 
1 - Especificidade enzimática 
 
a) Lavar bem a boca com água e coletar cerca de 8 mL de saliva (α-amilase salivar). 
b) Colocar em 4 tubos de ensaio numerados os seguinde volumes de enzima e reagente: 
• Tubo 1: 2,0 mL de sacarase 3% + 2,0 mL de sacarose 3% 
• Tubo 2: 2,0 mL de sacarase 3% + 2,0 mL de amido 1% 
• Tubo 3: 2,0 mL de saliva + 2,0 mL de sacarose 3% 
• Tubo 4: 2,0 mL de saliva + 2,0 mL de amido 1% 
Deixar à temperatura ambiente por 20 minutos. 
c) Adicionar, em seguida, a cada um dos tubos 2,0 mL do Reagente de Benedict. 
Aquecê-los em banho-maria até a ebulição. 
d)Observar em quais tubos houve atividade enzimática. 
 
2 - Termolabilidade 
 
 
 Sacarose Glicose Frutose 
Professor Alexandre Soares dos Santos DCB/UFVJM 2007 
a) Colocar em 2 tubos de ensaio numerados os seguintes volumes de enzima e 
reagentes: 
Tubo 1: 2,0 mL de sacarase 3% + 2,0 mL de água destilada; ferver diretamente na 
chama e resfriar sob água corrente. 
Tubo 2: 2,0 mL de sacarase 3% + 2,0 mL de água destilada. 
 
b) Adicionar aos tubos 2,0 mL de sacarose 3%. 
c) Incubar os dois tubos em banho-maria a 37ºC, por 10 minutos. 
d) Adicionar aos dois tubos 2 mL do Reagente de Benedict. Aquecê-los até ebulição 
(banho-maria). 
e) Observar em quais tubos houve atividade enzimática. 
 
3 - Atividade enzimática 
 
a) Enumere duas baterias de oito tubos de ensaio (de 0 a 7). 
b) Adicione 40 mL de solução de amido a 1 % a um erlenmeyer de 125 mL. Leve-o ao 
banho-maria a 37 ºC. 
c) Após cinco minutos, acrescente 1,0 mL de saliva filtrada em gaze, ao frasco 
erlenmeyer. Homogeneíze. Anote o tempo e retire duas amostras de 2,0 mL (tempo 
zero), uma para cada tubo 0, e adicione duas gotas de lugol ao tubo zero da primeira e 2 
mL do reativo de Benedict ao tubo zero da segunda bateria. NÃO RETIRE O FRASCO 
DO BANHO!! 
d) A cada três minutos, retire amostras de 2,0 mL do erlenmeyer, transferindo-as aos 
tubos seqüencialmente numerados e proceda com a adição dos reativos conforme 
realizado para o tubo zero (0). 
Observe os resultados e explique o que aconteceu.