Microscopia Eletrônica

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Microscopia Eletrônica em Biologia
Márcia Attias
Instituto de Biofísica UFRJ
mattias@biof.ufrj.br
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O que é um microscópio eletrônico?
Um pouco de história
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Sabemos como é um microscópio óptico
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Luz
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A descoberta dos elétrons
J.J.Thomson
1856-1940
www.chem.uiuc.edu 
 1897
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http://www.youtube.com/watch?v=70e5BG0Snc0
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Natureza ondulatória da luz e dos elétrons
Ernest Ruska
1906-1988
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O primeiro Microscópio eletrônico
Ernest Ruska
1906-1988
Pneumococus
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Os dois tipos de microscópio eletrônico
transmissão
varredura
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http://www.youtube.com/watch?v=fToTFjwUc5M
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Como se forma a imagem no microscópio eletrônico
de transmissão?
Elétron
barrado
Elétron
transmitido
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O feixe de elétrons interage com átomos da amostra
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O que pode deter um elétron?
Não desviado desvio elástico desvio inelástico
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Aqui o elétron foi
barrado
Aqui o elétron foi
transmitido
Imagens de carapaças de algas diatomáceas
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Tela de observação
Painel de controle
Fonte dos elétrons
Inserção das amostras
Chapas fotográficas
Vista geral do MET
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O Microscópio eletrônico é grande ou pequeno?
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Microscópio eletrônico de varredura (scanning)
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Claro: Cobre, escuro: Alumínio
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Filamento
Lentes
Amostra
Detector
imagem
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Como funciona?
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Amostras biológicas e o ME
Células:
Frágeis
Hidratadas
Muito espessas para o feixe de elétrons
Ambiente no interior do ME: vácuo e calor
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Porque as células não podem ser observadas vivas no Microscópio Eletrônico ?
Não pode haver água na coluna do microscópio
As células têm de ser resistentes ao feixe
As células precisam apresentar contraste
As células têm de ser cortadas em fatias finas
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FIXAÇÃO
Preservação da integridade morfológica x molecular
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Fixação de amostras
Fixar é matar a célula preservando sua estrutura
Pode ser Química ou
Física: congelamento
Criossubstituição
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Fixadores químicos
Permanganato de Potássio (KMnO4) 
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Contrastação negativa
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Formaldeído
Instável, preparado a partir de paraformaldeído. Não forma ligações cruzadas. Degrada rapidamente em metanol 
Preserva antigenicidade da amostra
Penetração rápida
Glutaraldeído
Forma ligações cruzadas com proteínas
Melhor preservação estrutural
Penetração mais lenta que o formaldeído
Fixadores químicos
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OsO4 – tetróxido de ósmio
Liga-se aos ácidos graxos insaturados
Age como contrastante
Age como mordente
Fixadores químicos
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Soluções tampão
Os fixadores são sempre diluídos em soluções tampão para
Manter o equilíbrio osmótico do material
Manter o pH próximo ao fisiológico
Tampões mais comuns 
Fosfato de Sódio
Cacodilato de Sódio
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?
Passo a passo da fixação
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Amostras precisam ser bem pequenas
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DIFUSÃO
Palavra chave:
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Proteção contra vapores e soluções
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DESIDRATAÇÃO
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Infiltração em resina
Em seguida, o fluido de transição será substituído por uma resina líquida.
Este processo é feito gradualmente ao longo de 24 horas.
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Tipos de resina
EPOXI
Hidrofóbicas
Polímeros de trama mais fechada
Polimerização a 60oC
METACRILATOS
Hidrofílicas
Polímeros de trama mais aberta
Polimerização a baixa temperatura sob U.V.
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 Quando as amostras estiverem completamente infiltradas na resina elas serão distribuídas em moldes e levadas à estufa...
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Na estufa a resina se solidificará.
Os blocos contendo as amostras podem ser retirados e desenformados.
48 horas
60oC
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Em seguida, os blocos são preparados para serem cortados em fatias ultrafinas.
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Ultramicrotomia
As amostras precisam ser cortadas em seções ultrafinas para que o
feixe de elétrons possa atravessá-las. Isto é feito num ultramicrótomo
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O bloco é preso no braço do instrumento. A cada oscilação do braço, há um pequeno avanço. Ao passar pelo gume de diamante da faca, uma fina fatia flutua sobre o espelho d´água
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Os cortes flutuam sobre um espelho d´água
Cortes ultrafinos (60 a 100 nm)
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Os cortes são recolhidos em telas de cobre
Cada tela tem 3 mm de diâmetro !
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A grade é então inserida no microscópio eletrônico de transmissão
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1965
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E para Varredura?
Até a desidratação tudo muito semelhante
A partir daí o espécime tem que secar, mas sem se deformar:
Secagem pelo ponto crítico do CO2
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Secagem pelo método do ponto crítico
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Quando é atingida a temperatura e pressão críticas, na qual TODO o CO2 passa ao estado gasoso: 31 ° C, 73825 bar
Isto é, a amostra fica SECA!
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A tampa da câmara é retirada
As amostras são colocada na câmara
Metalização
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A passagem de 
corrente pelo alvo “arranca” átomos de Au, que se espalham pela câmara e são atraídos pelas amostras, onde se depositam.
Findo o processo, a amostra está pronta para ir ao MEV
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Considerações sobre fixação química
De acordo com os fixadores e soluções utilizados é possível identificar seletivamente espécies moleculares ou proteínas, havendo metodologias específicas para a localização ou realce de vários componentes celulares.
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Citoquímica para enzimas
Citoquímica para carboidratos
Traçadores
Ouro coloidal
Microanálise
Eletrontomografia
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Princípios da Fixação a frio
Congelamento “instantâneo” do momento celular
Evita: sofrimento, difusão de solutos, deformação osmótica, alteração bioquímica
Problemas: velocidade de fixação em função da espessura da amostra
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Criofratura
Métodos de congelamento
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Métodos de congelamento
Plunge Freezing
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Métodos de congelamento
Congelamento por Alta pressão (High pressure freezing)
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Crio-Substituição
(freeze substitution)
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Crio-eletronmicroscopia
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