Aula14_Canais_e_Bombas

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Canais e Bombas de Membranas
Permeabilidade seletiva
• A bicamada lipídica é impermeável a íons e 
moléculas polares, mas às vezes é necessário que 
eles atravessem tais membranas.
• Para que isso seja possível, duas classes de 
proteínas de membrana fazem esta função: as 
bombas e os canais.
• As bombas usam uma fonte de energia (como 
ATP) para efetuar um transporte 
termodinâmicamente desfavorável, enquanto os 
canais apenas facilitam a difusão.
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Transporte em membranas
• Algumas moléculas (lipófilas) podem passar pelas 
membranas por se dissolverem na camada lipídica. 
Exemplo: esteróides.
• O sentido em que elas passarão por um processo de 
difusão simples, a favor de um gradiente de 
concentração.
• Se a molécula for muito polar, há outros fatores 
envolvidos: mesmo a favor do gradiente de 
concentração (143mM�14mM), o sódio não entra 
livremente na célula.
• Para que o sódio entre na célula, canais específicos 
permitem a difusão facilitada.
Medida da energia livre
• A energia livre relativa a gradientes de concentração 
pode ser medida (R é a constante universal dos gases 
(8,315*10-3kJ/mol ou 1,987*10-3kcal/mol):
• Para moléculas com carga elétrica, um termo adicional 
deve ser usado devido à repulsão por cargas iguais.
• Neste caso, os dois termos (devidos à concentração e à 
carga elétrica) são chamados conjuntamente de 
potencial eletroquímico ou potencial de membrana, e a 
energia livre é dada por:
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Transporte ativo
• Quando a diferença de energia livre é positiva, o 
transporte é desfavorável, precisando ocorrer 
com gasto de energia livre (em geral ATP).
• É o caso do transporte do sódio e potássio, feito 
pelas bombas de Na+ e K+ ou ATPases de Na+ e K+.
• Através da hidrólise de ATP, elas transportam 
sódio para fora da célula e potássio para dentro, 
contra os gradientes de concentração.
• Mais de um terço do ATP consumido por um 
animal em repouso é usado para bombear esses 
íons.
ATPases do tipo P
• Em geral, bombas de membranas podem 
existir em duas conformações: em cada um, os 
sítios de ligação a íons está aberto para um 
lado.
• Muitas informações sobre esses mecanismos 
foram obtidas através das estruturas da 
ATPase para Ca2+, uma ATPase do tipo P 
(nome devido à formação de um 
intermediário fosforilado)
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ATPase para Ca2+
• A ATPase para Ca2+ do retículo sarcoplasmático 
(SERCA) constitui 80% das proteínas da 
membrana do retículo sarcolasmático, tendo 
importante papel na contração muscular 
(disparada por um rápido aumento no nível de 
cálcio citoplasmático).
• O relaxamento muscular depende 
da eliminação do Ca2+ do 
citoplasma para o retículo 
sarcoplasmático (especializado para 
o armazenamento de cálcio) pela 
SERCA.
ATPase para Ca2+
• Cada íon cálcio é coordenado a sete átomos de 
hidrogênio de resíduos de ácido glutâmico, ácido 
aspártico, treonina e asparagina, além de grupos 
carbonil da cadeia principal e água.
• Quase metade da massa da proteína é 
constituída pela sua parte citoplasmática, 
composta pelo domínio N (que se liga ao 
nucleotídeo ATP), P (em que há a fosforilação de 
um ácido aspártico) e A (que pode servir como 
ativador da enzima unindo as alterações em N e P 
à porção transmembranar).
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Mecanismo da SERCA
• A SERCA funciona segundo o seguinte ciclo:
– No primeiro estágio, a proteína está defosforilada e ligada a 
dois íons de cálcio (Estado E1). Só pode haver troca de cálcio no 
lado citoplasmático.
– Ligando-se ao ATP, há um rearranjo dos domínios N, P e A, mas 
não na porção transmembranar. Os íons cálcio encontram-se 
aprisionados.
– Uma fosforila é transferida do ATP para o Asp351.
– Ao liberar ADP, a enzima inteira muda de conformação (Estado 
E2 ou E2-P quando fosforilada).
– No estado E2-P há rompimento da coordenação do Ca
2+, 
liberando-os no lado oposto.
– Hidrólise do fosforil-aspartato, liberando fosfato inorgânico.
– Com a defosforilação, as interações que estabilizam o estado E2
são perdidas, com a enzima voltando ao estado E1.
– Dois íons cálcio ligam-se à enzima novamente.
Mecanismo da SERCA
Molmovdb.org
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Inibição de bombas
• Alguns compostos, como os esteróides 
derivados de vegetais digitoxigenina e 
ouabaína (conhecidos como esteróides 
cardiotônicos), são potentes inibidores da 
bomba de sódio e potássio (Ki≈10nM).
• Tais compostos podem aumentar a força de 
contração do músculo cardíaco, possibilitando 
seu uso para o tratamento da insuficiência 
cardíaca congestiva.
Outras ATPases do tipo P
• O genoma de levedura revelou a presença de 16 
homólogos de ATPases do tipo P.
• Análises da seqüência sugerem que duas destas 
transportam íons H+, duas transportam Ca2+, três 
transportam Na+ e duas transportam metais 
como o Cu2+.
• Outros cinco membros aparentemente 
transportam fosfolipídeos contendo aminoácidos 
como “cabeça”.
• Com o advento do genoma humano, identificou-
se 70 ATPases do tipo P.
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Proteínas MDR
• A partir de estudos de doenças humanas, 
outra classe de bombas foram identificadas: 
as Proteínas MDR (do inglês multi drug
resistance).
• Estudando o fenômeno de resistência 
múltipla a fármacos, verificou-se correlação 
com a expressão de uma proteína de 170kD –
uma bomba dependente de ATP que extrai 
várias moléculas das células que as 
expressam.
Transportadores ABC
• Análises de seqüência das MDR e 
suas homólogas revelaram uma 
arquitetura comum, com quatro 
domínios, dois deles 
transmembranares e dois ligantes 
de ATP, chamados ABC (do inglês 
ATP binding cassette).
• Trassportadores que incluem esse 
domínio são chamados de 
Transportadores ABC, que em 
humanos apresentam 150 genes.
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Mecanismo dos transportadores ABC
• Pode-se também definir um ciclo para o mecanismo 
dos transportadores ABC:
– O primeiro estado consiste no transportador livre ATP e 
substrato, que pode se interconverter nas formas aberta e 
fechada.
– O substrato se liga na cavidade central da forma aberta do 
lado de dentro da célula. Mudanças conformacionais nos 
domínios ABC aumentam sua afinidade pelo nucleotídeo.
– O ATP se liga aos domínios ABC, gerando uma forte 
interação entre eles.
– Há uma consequente mudança nos domínios 
que atravessam a membrana, liberando o 
substrato para fora.
– A hidrólise do ATP com liberação de ADP e 
fosfato leva o transportador ao estado inicial.
Acoplamento de transportes
• Não necessariamente é necessário usar ATP 
para o transporte ativo – o transporte 
termodinamicamente desfavorável de uma 
molécula ou íon pode ser feita através do 
acoplamento com um transporte 
termodinamicamente favorável.
• Nesse caso, as proteínas são chamadas 
transportadores secundários ou co-
transportadores.
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Acoplamento de transportes
• Há proteínas que acoplam o fluxo 
favorável de uma molécula/íon ao 
fluxo desfavorável de outro em 
sentido contrário – nesse caso diz-se 
que ela efetua antiporte.
• Quando a proteína acopla o fluxo 
desfavorável ao fluxo favorável de 
outra molécula/íon no mesmo 
sentido, diz-se que ela efetua 
simporte.
Lactose permease
• A lactose permease é um dos transportadores 
secundários mais estudados, e acopla o 
transporte de H+ e de lactose para dentro da 
célula.
• O transporte de lactose para dentro da célula 
é desfavorável, portanto a energia livre vem 
do gradiente de concentração de H+, muito 
mais concentrado no exterior da célula.
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Ciclo da lactose permease
• Para efetuar o simporte,
a lactose permease
passa pelas seguintes etapas:
– As duas metades da molécula se orientam com a 
abertura para o lado externo da célula, e um próton 
externo se liga a um aminoácido na permease
(provavelmente Glu269).
– Na forma protonada, a permease se liga à lactose.
– A estrutura se everte, liberando a lactose e em 
seguida um próton para o interior celular.
– A estrutura se everte novamente, voltando ao estado 
inicial.
Canais iônicos
• Enquanto as bombas podem transportar milhares 
de íons por segundo, os canais iônicos podem 
fazer este transporte (no caso, passivo) em 
velocidades até mil vezes maiores, próximas às 
esperadas para a difusão livre em solução.
• Porém, eles não apenas permitem o fluxo livre 
dos íons, mas também são suscetíveis a variações 
físicas e químicas do ambiente, levando também 
a mudanças conformacionais.
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Impulsos nervosos
• O interior do neurônio (assim como a maioria das 
células) possui alta concentração de potássio e baixa 
de sódio, gradiente gerado pelas ATPases de Na+ e K+.
• A membrana apresenta potencial elétrico referente às 
concentrações iônicas externa e interna, sendo -60mV 
em repouso.
• Um impulso nervoso, ou potencial de ação, é gerado 
quando há uma despolarização desse potencial de 
membrana além de um valor crítico (e.g.: -60mV para -
40mV), que torna-se positivo dentro de 
aproximadamente 1ms (chega-se a aproximadamente 
30mV) antes de voltar ao valor negativo inicial.
Potenciais de ação
• Os potenciais de ação são resultado de alterações 
grandes mas transitórias na permeabilidade da 
membrana do axônio aos íons sódio e potássio.
• A passagem de Na+ pela membrana despolariza-a além 
do limiar, aumentando ainda mais a permeabilidade 
(realimentação positiva), levando à rápida e intensa 
mudança no potencial de membrana.
• Em seguida, a membrana se torna menos permeável 
ao sódio e mais permeável ao potássio, expulsando 
estes e levando o potencial de volta ao valor negativo, 
restaurado em poucos milissegundos.
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Patch-clamp
• Em 1976, Neher e Sakmann introduziram a 
técnica de patch-clamp, capaz de medir a 
condutância iônica em uma única célula.
• Uma micropipeta é comprimida contra uma 
célula, formando uma vedação.
• Essa vedação permite medidas de corrente 
com alta resolução pela aplicação de uma 
voltagem conhecida através da membrana, 
por intervalos de microssegundos.
Patch-clamp
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Obtenção de canais
• O canal de sódio foi purificado primeiramente a 
partir de enguias, usando como guia sua 
capacidade a se ligar muito fortemente 
(Ki≈10nM) à tetrodotoxina.
• Já a purificação dos canais de potássio foi muito 
mais difícil, devido à baixa quantidade e falta de 
ligantes conhecidos com alta afinidade. Ela 
ocorreu após a clonagem de um gene de mosca-
das-frutas, descobrindo-se que uma das 
subunidades do canal de potássio é homóloga a 
uma das unidades dos canais de sódio.
Estrutura do Canal de Potássio
• A especificidade iônica do canal de potássio 
pode ser compreendida através de sua 
estrutura cristalográfica.
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Estrutura do Canal de Potássio
• O diâmetro inicial do poro é de 10Å, estreitando-
se para uma cavidade consideravelmente menor 
(3Å).
• A abertura externa e a cavidade central são 
preenchidas com água, e um íon de potássio 
pode se adaptar ao poro ainda solvatado.
• Na porção mais estreita, os íos
devem doar as moléculas de água 
e interagir diretamente com a 
proteína, o que ocorre com as 
carbonilas da sequência TVGYG
Permeabilidade seletiva
• Os canais de potássio são 100 vezes mais 
permeáveis ao potássio que ao sódio.
• Íons com raios maiores que 1.5Å não passam na 
porção mais estreita (o potássio tem ráio 1.33Å).
• O sódio não solvatado poderia passar (raio 
0.95Å). Porém, como a dessolvatação do sódio 
não é tão favorável que a do potássio (devido à 
orientação das carbonilas), ele acaba não tendo 
seu transporte facilitado.
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Canais acionados por voltagem e 
ligantes
• Há canais de sódio e potássio* acionados pelo 
próprio potencial de membrana. Nestes canais, a 
diferença de potencial leva a uma mudança de 
conformação que abre ou fecha o canal.
• Há também aqueles ativados por ligantes, como o 
receptor de acetilcolina, que quando da ligação 
desta molécula altera sua permeabilidade a íons 
(tanto sódio quanto potássio), disparando um 
potencial de ação.
Junções em fenda (gap junctions)
• As junções em fenda ou canais de célula a 
célula são vias de passagem entre células 
adjacentes, com um orifício central de 20Å.
• Pequenas moléculas hidrofílicas e íons podem 
passar. Isso ocorre para todas as moléculas 
polares abaixo de 1kD, o que 
inclui muitos metabólitos como 
oses, aminoácidos e 
nucleotídeos.
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Junções em fenda (gap junctions)
• Elas são importantes para a comunicação 
intercelular, permitindo respostas 
sincronizadas a estímulos.
• Estes canais ligam citoplasma 
a citoplasma, atravessando 
duas membranas ao invés de 
uma.
• Eles podem ser bloqueados por 
Ca2+ e H+, isolando células normais de 
vizinhas traumatizadas ou mortas, além de 
poderem ser controladas por potencial de 
membrana e fosforilação.
Canais para permeabilidade à água
• Há também canais que não transportam íons ou 
pequenas moléculas, mas aumentam a 
velocidade de difusão da água pelas membranas.
• Embora a água já seja capaz de passar pela 
membrana, às vezes isso precisa ser feito de 
forma rápida, como nos rins ou na secreção da 
saliva e das lágrimas.
• Essas proteínas são chamadas aquaporinas, e 
possui um canal hidrofílico que permite a 
passagem de água a 106 moléculas por segundo.
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Aquaporinas
• A estrutura da aquaporina foi determinada, o 
que também possibilitou a sua utilização para 
simulações de dinâmica molecular.
Theoretical and Computational Biophysics group
Urbana-Champaign
Pesquisa no ICB