Prática 5 - Propiedades de proteínas

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Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri 
Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde 
Departamento de Ciências Básicas 
Disciplina: Bioquímica 
 
AULA PRÁTICA Nº 5 – Propriedades das Proteínas 
 
 
Precipitação de Proteínas: pI e força iônica 
 
As proteínas são muito sensíveis à variação de pH, podendo adquirir uma forma 
aniônica, catiônica ou zwitteriônica, o que altera propriedades como sua solubililade e 
atividade catalítica. Quanto maior o grau de ionização de uma proteína, maior será sua 
tendência à solvatação. No ponto isoelétrico (pI), a proteína tem carga líquida igual a zero, 
o que diminui a repulsão entre as moléculas protéicas e o grau de solvatação provocando a 
agregação e floculação das moléculas. Esse fenômeno é chamado de precipitação 
isoelétrica. 
A solubilidade das proteínas também varia com a força iônica do meio. A força 
iônica é uma medida da concentração de partículas carregadas no meio. De maneira geral, 
as proteínas apresentam solubilidades diferentes em relação a um determinado pH quando a 
força iônica do meio é variada. A solubilidade das proteínas aumenta exponencialmente 
com o aumento da força iônica até uma região de máximo (salting in) e, decai com 
concentratrões elevadas do sal, ou força iônica, fenômeno conhecdo como ‘salting out’. 
Esse comportamento ambíguo pode ser explicado por um etapa em que a adição de íons 
intermedia uma interação entre a água e as proteínas, aumentando sua solvatação e, em um 
segundo momento, com a adição continuada de íons há um decréscimo na atividade da 
água favorecendo a interação entre as micelas protéicas e daí desencadeando o processo de 
precipitação (salting out). 
 
 
Reagentes 
 
- Solução de caseína em acetato de sódio 0,1 mol/L 
- Solução de clara de ovo (ovalbumina) 50% 
- Reagente de Biureto 
- Solução de ácido clorídrico a 1,0 mol/L 
- Solução de hidróxido de sódio a 1,0 mol/L 
 
PROCEDIMENTOS 
 
1. Precipitação de Proteínas por ‘Salting Out’. 
 
• Pipetar 1 mL de uma solução de clara de ovo a 50% em um tubo de ensaio. 
• Adicionar 3 mL de sulfato de amônio saturado. 
• Observar o que acontece. 
 
2. Precipitação de Proteínas pelo Calor. 
 
• Pipetar 1 mL de solução de clara de ovo 50% em um tubo de ensaio. 
• Aquecer em banho de água em ebulição por 5 min. 
• Observar o turvamento da solução. 
• Em geral, as proteínas diminuem a solubilidade com a temperatura, devido à 
desnaturação. Ocorre a exposição dos radicais hidrofóbicos, que normalmente são 
encontrados no interior da molécula, levando a uma redução da solubilidade. 
 
3. Precipitação Isoelétrica de Proteínas. 
 
Adicionar 50 ml de água aquecida em 50 ml de leite. Medir pH com fita indicadora. 
a) Adicionar HCl 1,0 mol/L, gota a gota, com agitação constante, até 
coagulação do leite. 
b) Medir o pH com papel indicador no momento que houver coagulação do 
leite. 
c) Separar 2 mL do soro do leite em um tubo de ensaio. 
d) Separar 2 mL da suspensão contendo a proteína precipitada em dois tubos de 
ensaio e adicionar HCl ou NaOH gota a gota, agitando a cada adição. O que 
acontece? 
 
4. Determinação qualitativa de proteínas. 
 
 
 Reação de Millon: 
 
1. Adicionar a um tubo de ensaio 3mL do soro de leite; 
2. Colocar em outro tubo de ensaio 3mL da suspensão de proteínas 
coaguladas e adicionar gotas de NaOH 1mol/L até solubilizar as proteínas; 
3. Adicionar 5 gotas de reativo Millon em cada tubo. Observar a formação 
de um precipitado branco. Agitar; 
4. Aquecer gradualmente à chama. Observar a coloração vermelha que 
adquire o precipitado ou a mistura. 
 
 Reação de Biureto: 
 
1. Colocar em um tubo de ensaio 2mL do soro do leite; 
2. Colocar em outro tubo de ensaio 2mL da suspensão de proteínas 
coaguladas e adicionar gotas de NaOH 1mol/L até solubilizar as proteínas; 
3. Adicionar 2mL da solução de biureto; 
4. Agitar. O aparecimento de coloração violeta indica reação positiva. 
 
 
 
 
 
Interpretações: 
 
1º ) Precipitação Isoelétrica das Proteínas: 
 As proteínas quando são levadas até um pH que corresponde ao seu pI, 
tornam-se insolúveis e se precipitam nas soluções em que estão contidas. No 
caso da caseína do leite, ela se precipita em pH próximo de 4,5 que corresponde 
a seu pI. As proteínas que permanecem solúveis foram albuminas e globulinas. 
 Este método permite a separação de proteínas. 
 
2º ) Reação de Millon: 
 A reação positiva, isto é, formação do precipitado com coloração 
característica é devido a presença de proteínas que possuem o grupamento 
fenólico da tirosina. 
 O Reativo Millon é constituído de mercúrio em ácido nítrico dissolvido 
em água. Obtêm-se uma mistura de nitrato de mercúrio (I) e nitrato de mercúrio 
(II) em ácido nítrico. A reação se processa de acordo com a seguinte equação, 
havendo nitro-mercuriação do grupo fenol na posição orto em relação ao grupo 
hidroxila: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 3º ) Reação de Biureto: 
 Serve para identificar a presença de proteínas, polipeptídeos, tripeptídeos. 
O biureto, quando em solução alcalina, reage com íons cobre (CuSO4), 
formando um complexo de cor rosa a violeta. 
 Como as proteínas possuem em sua estrutura ligações peptídicas 
semelhantes às do biureto (H2NCONHCONH2), elas também dão reação 
positiva com o cobre. 
 
CH2
OH
C COO-
H
H3N
+
CH2
OH
HgNO3
C COO-
H
H3N
+
Hg(NO3)2
HNO3