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Teoria 
Cromatografia de Íons
 Bruno Fernando Moreira
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O que é cromatografia?
Método físico-químico de separação de dois ou mais compostos (analitos) diferentes para análises qualitativas ou quantitativas. 
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O que é cromatografia?
A separação depende da diferença de comportamento do(s) analito(s) entre as duas fases, móvel e estacionária. A interação analito / fase móvel / fase estacionária depende das forças intermoleculares, como iônica, apolar, e efeitos de afinidade e solubilidade.
Método desenvolvido por Mikhail Tswett (1903), que consistia na separação de pigmentos vegetais presentes em um extrato de plantas. A mistura apresentava uma única coloração inicial, mas quando passada por uma coluna esta se decompunha em várias cores diferentes. 
Histórico
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Experimento de Tswett
Fase Estacionária
CaCO3
Fase Móvel
Éter de petróleo
Amostra
Extrato vegetal
Experimento de Tswett
Definição
 Método físico-químico de separação de misturas.
 Presença de duas fases: Estacionária e móvel.
 Separação devido à diferença de interação entre as substâncias e as duas fases.
 Análise qualitativa e/ou quantitativa.
Classificação
Cromatografia
em coluna
Cromatografia
 gasosa
Fase Reversa
Iônica
Fase normal
Cromatografia
líquida
Exclusão 
molecular
Cromatografia
 supercrítica
Componentes de um cromatógrafo
1 - Eluente 3 - Injetor 5 - Coluna 
2 - Bomba 4 - Amostra 6 - Detector
Comparação HPLC X IC
Eluente
Fase móvel: transporte dos analitos;
Competição íons do eluente com íons da amostra.
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Eluente
 Compatibilidade com detecção;
 Natureza química e concentração;
 Utilização de água ultrapura;
 pH;
 Força de eluição;
 Modificadores orgânicos (acetona, acetonitrila);
 Isocrática ou Gradiente;
 Eluentes com Complexantes.
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Tipos de eluentes
ânions (I)
 ácido Ftálico;
 ácido Salicilico;
 ácido p-Hidroxibenzoico; 
 ácido Benzoico;
 Borato;
 Borato/Gluconato;
 Hidróxido de Potássio;
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ânions (II)
 Carbonato / Bicarbonato;
 Hidróxido de Potássio;
 Borato.
cátions (I)
 Ácido Nítrico;
 Ácido Tartarico;
 Ácido Tartarico / Ácido Dipicolínico;
 Ácido Tartarico / Ácido Cítrico;
 Dihidrogeno Fosfato de Sódio;
 Ácido Oxálico / Etileno Diamina / Acetona;
...
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Bomba de eluentes
Fabricada em PEEK, material com alta resistência, inerte ao ataque de compostos iônicos;
Dispensa o uso de gases externos;
Duplo pistão: menor ruído;
Deve possuir dispositivo para purga, visando preenchimento completo de líquido nos capilares.
Válvula de injeção
Válvula de 6 vias;
Loop (alça de amostragem).
Posição Fill
(Preenchimento do loop)
Posição Inject
(Injeção da amostra)
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Coluna e pré-coluna
Evita contaminação da coluna;
Pré: mesmo material da coluna;
Coluna de guarda: material diferente.
Promove a separação dos íons;
Formada por material polimérico compactado (PDVB/PS, SiO2, PMMA, Polivinil-álcool e outros), com terminais positivos (R-NH3+) ou negativos (R-SO3-).
Coluna ou Fase estacionária
 um substrato ou imobilizador
 um grupo espaçador 
 um grupo com capacidade de 
 separação
Substratos
 Poliestireno/divinilbenzeno
 Polimetacrilato
 Silicato / sílica gel
 Hidroxietilmetacrilato (HEMA)
Trocadores Aniônicos
 quarternário de amônio
 aminas alquílicas
 hidroxi alquilaminas
 aminas alquílicas com acrilato (tipo “crosslink”)
Trocadores Catiônicos
 grupos sulfonados
 grupos carboxilatos
Espaçadores
 cadeia alquílica
Reação de Troca Iônica
Fraca interação iônica com a fase estacionária.
Coluna com grupo quaternário de amônio: separação de ânions por troca iônica
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Coluna com grupo sulfônico: separação de cátions por troca iônica
Fraca interação iônica com a fase estacionária.
Reação de Troca Iônica
Exclusão Iônica
Coluna com grupo sulfônico: separação de ácidos orgânicos por exclusão iônica
 Adicionando íons H+ há a formação de uma membrana polar (Membrana de Donnan).
Componentes de um cromatógrafo
Supressor Químico
 Para analise de ânions, reduz a condutividade do eluente através de troca catiônica.
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Coluna 
Analítica
FM (Na2CO3)
Amostra
F-, Cl-, SO4-2
NaF, Na2CO3,
NaCl, Na2SO4
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Supressor Químico
 Dispositivo capaz de registrar a passagem, em fluxo, de um composto presente no eluente.
 Características:
- Temperatura estabilizada;
- Partes em contato com líquidos (eluente e os compostos separados pela coluna) devem ser inertes;
- Menor caminho possível após a coluna cromatográfica.
Detector
Coluna
Detector
Monitor
Principio
Coluna
Detector
Monitor
Principio
Coluna
Detector
Monitor
Principio
Coluna
Detector
Monitor
Principio
Coluna
Detector
Monitor
Principio
Coluna
Detector
Monitor
Principio
Coluna
Detector
Monitor
Principio
Coluna
Detector
Monitor
Principio
Coluna
Detector
Monitor
Principio
Coluna
Detector
Monitor
Principio
Coluna
Detector
Monitor
Principio
Coluna
Detector
Monitor
Principio
Coluna
Detector
Monitor
Principio
Coluna
Detector
Monitor
Principio
Coluna
Detector
Monitor
Observar a separação dos analitos
Detecção por Condutividade;
Detecção por Amperometria:
		- Potencial Fixo;
		- Pulsada; 
Detecção por UV-Vis:
		- Direta;
		- Com reação Pós-Coluna;
Tipos de Detecção
 Condutimetria = medida de condutividade;
 Aplicação de campo elétrico;
 Ânions migram para o Ânodo;
 Cátions migram para o Cátodo;
 Corrente alternada;
 Medida da resistência elétrica da solução. 
Detector Condutimétrico
R = resistência []
Kc = Constante da Célula [1/cm]
 = Condutividade [1/  ou S]
Distância L
Área A
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Detector Espectrofotométrico
(UV – Vis)
Lei de Lambert - Beer
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Detector Espectrofotométrico
(UV – Vis)
 Utilizado para íons com absorbância em um determinado comprimento de onda. Ex.: nitrito, nitrato, brometo;
 Muito utilizado para eliminar interferência de analitos não ativos (cloreto);
 Eluente deve absorver no UV ou Vis.
Lei de Lambert - Beer
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Detector Espectrofotométrico
(UV – Vis) com PCR
 Determinação com seletividade;
 Necessidade de reagentes específicos;
 Sistema de complexação;
 Depende da combinação reagente – eluente.
Lei de Lambert - Beer
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Detector Espectrofotométrico
(UV – Vis)
Lei de Lambert - Beer
 Cromóforo = substâncias capazes de absorver energia na região do UV-Vis e excitar-se para emitir diversas cores.
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Detector Amperométrico Fixo - DC
 Um potencial definido é aplicado em um sistema de três eletrodos (trabalho, referência e auxiliar). Este potencial oxida ou reduz o analito, promovendo uma reação na superfície do eletrodo de trabalho com transferência de elétrons, sendo detectada a corrente resultante;
 Larga variedade para materiais de eletrodo (carbono vítreo, prata, ouro);
 Alta sensibilidade;
 Muita seletividade;
 Excelente performance.
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Detector Amperométrico Fixo - DC
791 VA Detector
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Detector Amperométrico Pulsado
 Mesma técnica do potencial fixo – três eletrodos;
 Potencial passa por três etapas por leitura;
 Muito usado para analitos com alto poder de oxidação;
 Muito usado para análise de altos teores orgânicos.
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Bioscan
Detector Amperométrico Pulsado - PAD
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Detector Amperométrico
 As células podem ser classificadas conforme o arranjo dos eletrodos e do fluxo do eluente:
 A célula pode possuir eletrodos de trabalho e referência móveis ou fixos.
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Célula Eletroquímica
input
output
Eletrodo de trabalho (Au, Ag, Pt, GC)
Eletrodo auxiliar
Eletrodo de referência de estado sólido
Wall – Jet para Bioscan
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CélulaEletroquímica
Thin – Layer para Bioscan
Possibilidade de trocar o eletrodo de trabalho para diferentes aplicações!!
 Eletrodo de GC
 Apenas modo DC 
 Potencial do eletrodo de trabalho: 	Meio alcalino: - 1.50 V  + 0.60 V 	Meio ácido: - 0.80 V  + 1.30 V
 Aplicações:
 catecolaminas, aminas aromaticas
 ânions inorgânicos (nitrito, sulfeto ...)
 fenols
 vitaminas
 alguns aminoácidos
Célula Eletroquímica
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Eletrodo de Au
 Potencial do eletrodo de trabalho:	
 Meio alcalino: - 1.25 V  + 0.75 V Meio ácido: - 0.35 V  + 1.10 V
 Aplicações:
 mono-, di-, oligo- e polissacarídeos
 açúcares alcóolicos
 açúcares ácidos
 aminoácidos
 antibióticos
Célula Eletroquímica
Eletrodo de Pt
 Modos DC e PAD
 Potencial do eletrodo de trabalho: 	Meio alcalino: - 0.90 V  + 0.65 V 	Meio ácido: - 0.20 V  + 1.30 V
 Aplicações:
 álcoois e glicóis
 peróxido de hidrogênio
 hidrazina
 arsenito, hipoclorito
Célula Eletroquímica
Eletrodo de Ag
 Modos DC e PAD
 Potencial do eletrodo de trabalho: 	Meio alcalino: - 1.20 V  + 0.10 V 	Meio ácido: - 0.55 V  + 0.40 V
 Aplicações:
 haletos
 cianeto, sulfeto
 tiossulfato
 farmacêutica
Célula Eletroquímica
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Célula Eletroquímica
Célula eletroquímica 
Eletrodo de trabalho
Eletrodo de referência
Wall – Jet para 791 VA
Recomendações preliminares
Antes de iniciar o trabalho é necessário ter consciência de que o equipamento é bastante sensível.
Portanto alguns cuidados devem ser respeitados para a obtenção de bons resultados, redução de manutenção e elevação da vida útil do equipamento e consumíveis.
Água
Para preparar eluentes e regenerantes, diluir amostras e padrões, e lavar a vidraria para cromatografia de íons é necessário o uso de água de alta pureza.
A especificação de qualidade de água mais importante é a ASTM D1193-99 (Reagent Water Standard Specification), onde a água do Tipo I (Resistividade: min 18MOhm; Na: 1 ppb; Cl: 1 ppb; TOC: máx 10 ppb) é aceitável para o uso.
Reagentes
Ao comprar reagentes, dê preferência aos de alta qualidade e pureza. Interferentes presentes nos reagentes podem se concentrar na coluna provocando danos, muitas vezes dífíceis de se reverter. 
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Amostras
As amostras devem ser filtradas (0,45 μm) para evitar entupimento e danos no sistema;
Diluição de amostras concentradas para evitar danos na coluna.
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Amostras
Ultra-filtração (inline): amostras contendo material finamente particulado;
Diálise: amostras com material emulsionado;
Para um melhor desempenho, também podem ser efetuadas etapas com cartuchos especiais para remoção de certos compostos ou para neutralização.
Vidrarias e ambiente de trabalho
Bom resultados em baixas concentrações requerem laboratório limpo e eliminação de fontes de vapores (HCl, amônia, ac. acético e outros) que são interferentes;
A vidraria deve ser muito bem lavada com várias porções de água ultrapura para eliminação de vestígios.
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Interpretação de resultados
Principais informações de um cromatograma:
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Materiais de laboratório muito bem limpos 
Reagentes de alta qualidade
Uso de água ultra-pura (18,2MOhms de resistividade), isenta de material orgânico e/ou particulado)
Ambiente de trabalho isento de contaminações
Amostras filtradas ou devidamente preparadas
REQUISITOS PARA MELHORES RESULTADOS, MENORES GASTOS COM MANUTENCAO, MAIOR NUMERO DE INJECOES POR COLUNA
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Análise qualitativa
AMOSTRA
PADRÃO
Comparação de cromatogramas da amostra e de uma solução padrão do analito suspeito
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Adição de padrão
Amostra complexa: incerteza nos t’R medidos pode levar a identificação errônea
Pico duvidoso?
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Adição de padrão
Comparação com cromatograma da amostra dopada permite identificação mais confiável do pico desconhecido
Confirma que existe este analito na amostra!
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Análise quantitativa
 Calibração externa:
Solução contendo padrões de todas as substâncias a serem analisadas;
Padrões em concentrações próximas à amostra;
Condições analíticas devem ser as mesmas, inclusive o volume de injeção.
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 Curva de calibração:
Uma técnica comparativa de padrão em relação a amostra através da criação de equações de 1 ou 2 grau;
Injeção de padrões de concentração conhecida;
Recomendável a utilização de 3 a 5 pontos com repetibilidade (determinação da faixa de análise).
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 Curva de calibração:
 Parâmetros da curva de calibração:
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 Comparação dos cromatogramas:
A freqüência do tempo de retenção e as diferentes áreas do pico podem ser constatadas através de uma sobreposição de cromatogramas
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Muito obrigado
pela atenção!
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